论文摘要
吗啡（morphine）等阿片类受体激动剂（opioid receptor agonists）是临床上应用最为广泛的强效镇痛药。该类药物能有效缓解患者的疼痛，尤其是大型手术（如截肢、开胸术、器官移植等）所造成的剧烈疼痛和晚期癌症患者的长期重度疼痛。然而长期或不正确的使用该类药物极易导致患者出现成瘾、耐受、痛觉过敏和呼吸抑制等严重的不良反应。这些不良反应的出现反而加重了患者的痛苦，进一步降低患者的生活质量。其中，该类药物所致的镇痛耐受（analgesictolerance）和痛觉过敏（hyperalgesia）是两个密切相关且易被混淆，但却彼此不同的症状。前者指的是机体在长期应用阿片类受体激动剂后，该类药物的镇痛效应出现显著性下降，需要给予机体更大剂量的药物才能达到或维持与最初相同的镇痛效应；换言之，该类药物镇痛效应的剂量-效应曲线发生了右移。后者是指患者在长期或不正确应用吗啡等阿片类受体激动剂后，其对非伤害性刺激出现异常的痛觉反应，或是对相同的伤害性刺激出现高度敏感的痛觉反应。因此，镇痛耐受是药物缓解机体疼痛反应的能力下降，而痛觉过敏是机体对疼痛刺激的反应性增高。镇痛耐受和痛觉过敏虽然是由阿片类受体激动剂所诱发的两个不同的不良反应，但是它们彼此在发生与发展上具有密切的相关性。研究发现，这两种不良反应在形成机制上均涉及脊髓中神经的可塑性改变。这种改变包括兴奋性氨基酸（excitatory amino acid，EAA）合成与释放非增加，兴奋性氨基酸受体的激活，以及随后所触发的一系列细胞内信号转导事件，包括钙离子（Ca2+）内流，一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）激活，一氧化氮（nitric oxide，NO）合成增多，蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）转位与激活等。这些由长期应用阿片类受体激动剂所诱发的细胞内级联放大事件最终促进了镇痛耐受和痛觉过敏的形成与发展。归元（Guiyuan）是本课题组自行研发的一种中药复方片剂。该复方制剂中包含有人参、地不容、黄芪等中草药的提取物。我们过去的研究发现，该复方制剂在动物实验中能有效抑制吗啡所诱发的小鼠行为敏化（behavioralsensitization）、大鼠条件位置偏（conditioned place preference，CPP）和大鼠海马长时程增强（long-term potentiation，LTP）改变。之后的临床实验研究结果显示，该复方制剂能有效地治疗吗啡成瘾患者的戒断症状。此外，我们还发现归元在小鼠热板实验（the hot-plate test）和醋酸扭体实验（the acetic acid writhing test）中显示出一定的镇痛作用。然而，该复方制剂在与吗啡联用后，是否能增强吗啡镇痛效应并抑制吗啡所诱发的镇痛耐受和痛觉过敏等不良反应尚未清楚。因此，本课题的研究内容如下：研究目的：评价归元是否能拮抗吗啡所诱导的镇痛耐受和痛觉过敏的发展，并初步探讨其作用机制，希望将其开发成能有效增强吗啡镇痛，抑制吗啡所致成瘾、镇痛耐受和痛觉过敏等不良反应的临床镇痛佐剂。研究方法：在本次课题研究中，我们采用小鼠热板实验对归元镇痛作用及其与吗啡合用后镇痛作用的时效关系和量效关系进行了系统性评价。同时，我们还通过建立小鼠吗啡急性镇痛耐受模型、慢性镇痛耐受模型以及已建镇痛耐受模型来系统性地评价归元对吗啡所诱发的镇痛耐受和痛觉过敏的影响，并在吗啡已建镇痛模型的基础上，收集和制备小鼠脊髓组织样本，利用试剂盒检测小鼠脊髓组织中一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）的活性和一氧化氮（nitric oxide，NO）的含量，以初步探讨归元片对吗啡镇痛耐受和痛觉过敏影响的作用机制。研究结果：1.中药复方制剂归元片具有弱至中效的镇痛作用，其经灌胃给药后在小鼠热板实验中镇痛效应的ED50值为523.5mg/kg（95%CI:362.2-756.8mg/kg）。归元低剂量（200mg/kg）无明显的镇痛作用；中剂量（400mg/kg）具有一定的镇痛效应，其最大镇痛率（the percentage of maximum possible analgesiceffect，%MPAE）为给药后60min的52.04±12.49%，且有效的镇痛效应可持续至给药后120min；高剂量（800mg/kg）的镇痛效应与5mg/kg吗啡经皮下注射给药后30min的效应（%MPAE=70.94±12.98%）相当，最大镇痛率为给药后60min的78.57±10.58%。2.中药复方制剂归元片，无论是其有镇痛作用的中剂量（400mg/kg）还是无镇痛作用的低剂量（200mg/kg），与吗啡联用后均能显著延长吗啡镇痛作用的持续时间；在单独使用吗啡时，其镇痛作用于皮下注射给药后90min基本降至阴性对照组水平，然而当其与归元低剂量、中剂量联用时，镇痛效应在给药后300min仍然十分显著，%MPAE分别为51.58±12.80%和52.48±11.28%。吗啡单独给药时，其镇痛作用的ED50值为4.67mg/kg（95%CI：3.87-5.64mg/kg），而归元中剂量（400mg/kg）与吗啡联用后能有效降低后者镇痛作用的ED50值至0.65mg/kg（95%CI：0.40-1.06mg/kg）。3.中药复方制剂归元片，无论是无镇痛作用的低剂量（200mg/kg）还是具有一定镇痛作用的中剂量（400mg/kg）、高剂量（800mg/kg），均能有效地抑制吗啡所致急性镇痛耐受、慢性镇痛耐受和这两种镇痛耐受模型中动物痛觉过敏的发展。在吗啡诱导的已建耐受实验中，归元低剂量（200mg/kg）能有效逆转吗啡所致的已建镇痛耐受，但是对于吗啡所致的已建痛觉过敏却没有显示出显著的逆转作用。4.吗啡已建镇痛耐受模型小鼠脊髓样本中NOS活性和NO含量的检测结果显示，中药复方制剂归元片本身对脊髓神经元中NOS活性和NO含量无影响，然而其与吗啡自第一日起联合用药却能有效抑制吗啡诱导的高水平的NOS活性和NO含量。此外，该中药复方制剂对由吗啡诱导的已形成的NOS活性和NO含量的高水平状态无显著的逆转作用。研究结论：中药复方制剂归元片与吗啡联用后具有协同镇痛的作用，并能显著延长吗啡镇痛作用的持续时间，在临床上治疗疼痛时，该复方制剂可以减少吗啡每次用药剂量和延长给药时间间隔。同时，归元片作为一个能治疗吗啡成瘾的中药复方制剂，也显示了其拮抗吗啡镇痛耐受和痛觉过敏的优势，从而减少吗啡上述严重不良反应。因此，归元片有望发展成为一个辅助吗啡等阿片类药物而用于临床中疼痛治疗的有效镇痛佐剂。Opioid receptor agonists, such as morphine, are powerful analgesics whichwidely used in clinic. This kind of drugs effectively relieve the pain of patients,especially for the severe pain caused by large scale operations (e.g. amputation,thoracotomy, and organ transplantation) and the chronic pain induced by the terminalcancer. However, long-term or uncorrected using of these drugs easily results in manyserious adverse effects such as addiction, analgesic tolerance, hyperalgesia andrespiratory depression. These adverse effects reversely aggravate the pain of patientsand further decrease the quality of their life. Among them, analgesic tolerance andhyperalgesia are two different symptoms induced by opioid receptor agonists, but theyare closely interrelated and easy to be confused. The former is that after chronicadministration of opioid receptor agonists, the analgesic effect of these drugs appearsa significant decrease and a larger dose is needed to reach or maintain the sameanalgesic effect as well as original; in other words, there is a shift to right in thedose-effect curve of the analgesic effect of opioid receptor agonists. The latter is thatafter long-term or uncorrected application of opioid receptor agonists, the bodydevelops an abnormally painful response to innocuous stimulus or an increasedresponse to the same nociceptive stimulus. So the analgesic tolerance means adecreased ability of drugs to relieve the painful response of the body, and thehyperalgesia means an increased response of the body to painful stimulus.Although the analgesic tolerance and the hyperalgesia are two different adverseeffects induced by opioid receptor agonists, there are many closely interrelations intheir respective generation and development. A body of evidence suggested that theforming mechanisms of these two adverse effects were all involved in the neuronalplastic changes within the spinal cord. The changes contain an increase of excitatoryamino acid (EAA) synthesis and release, activation of EAA receptors and subsequentintracellular signaling events, including Ca2+influx, nitric oxide synthase (NOS)activation, nitric oxide (NO) production, protein kinase C (PKC) translocation and