论文摘要
躯体某一部位损伤后,除了损伤的部位出现自发性疼痛或者痛敏外,身体对侧相对应的部位也出现自发痛或痛敏的现象,称为镜像痛(Mirror-imagePain),它是神经病理性疼痛中的一种特殊现象。至今镜像痛的发生机制尚不清楚,越来越多的证据表明,脊髓内星形胶质活化在神经病理性疼痛的发生发展中起着重要的作用,但星形胶质细胞的活化和星形胶质细胞缝隙连接之间的关系在镜像痛的形成中发挥怎样的作用目前还没见文献报道。于是我们提出一个假设即在一侧外周神经损伤的情况下,术侧脊髓背角释放更多神经递质,然后通过PKC通路使CX43蛋白磷酸化,增强缝隙连接通讯的功能,使星形胶质细胞通过缝隙连接有术侧活化到对侧,引起镜像痛。缝隙连接(gap junction, G J)是细胞问进行信息直接交流的一种方式。缝隙连接是由特殊的连接蛋白(connexin, CX)构成的两个半通道互相锚定而成。可允许离子和其他一些小分子物质,如三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸肌醇(IP3)、环磷酸腺苷(cAMP)及一些小分子氨基酸自由通过。在中枢神经系统内,星形胶质细胞缝隙连接蛋白主要是有缝隙连接蛋白43(CX43)构成。CX43的表达量对缝隙连接通讯功能有重要的作用。在一些神经病理性疼痛模型中(脊髓损伤),脊髓星形胶质细胞内CX43高表达,这可能提示神经病理性疼痛中缝隙连接通讯功能是增强的。我们选择了坐骨神经分支选择性损伤模型(spared nerve injury, SNI)来验证缝隙连接通讯对镜像痛的影响。通过鞘内注射甘珀酸(carbenoxolone, CBX),一种缝隙连接通讯阻断剂,发现术后连续给药5天,降低了脊髓双侧的星形胶质细胞的活化,同时缓解了大鼠双侧后肢的机械缩足阈值。这说明缝隙连接通讯在镜像痛的发生中起着重要的作用,且可能是通过减少星形胶质细胞的活化实现的。因为在前期的实验已经证明了抑制星形胶质细胞活化可以缓解大鼠的镜像痛。神经损伤后我们通过鞘内注射甘珀酸可以间接反映出缝隙连接的通讯功能是增强的,而没办法直接在动物体内去验证缝隙连接的通讯功能。于是我们通过体外星形胶质细胞的培养,用谷氨酸刺激培养的星形胶质细胞,来模拟疼痛环境,观察在疼痛的情况下缝隙连接通讯功能的变化。缝隙连接蛋白的表达及磷酸化形式对缝隙连接通讯功能的影响有重要的作用。CX43蛋白的半衰期较短(1-5h),且其磷酸化形式是动态的,可以有不同的磷酸激酶调节。其磷酸化形式可以影响CX43蛋白的半衰期,及通道的开放和关闭状态。有报道显示,星形胶质细胞之间的缝隙连接通讯功能可以被蛋白激酶C(PKC)调节,其作用是通过磷酸化CX43蛋白的羧基端365磷酸化位点而实现的。另外,缝隙连接通讯功能和星形胶质细胞的活化也有着重要的关系。于是,我们同时也探讨了缝隙连接通讯功能的改变和CX43蛋白磷酸化的关系,及缝隙连接通讯功能和星形胶质细胞活化的关系。实验结果表明,在谷氨酸刺激的情况下,PKC蛋白增加,CX43磷酸化增加,星形胶质细胞缝隙连接通讯功能增强,星形胶质细胞活化增加。而给予PKC抑制剂之后,CX43的磷酸化降低,同时缝隙连接通讯功能降低,星形胶质细胞活化减少,表明CX43的磷酸化可以增强缝隙连接的通讯功能。那么缝隙连接的通讯功能增强是否会影响星形胶质细胞的活化,我们给予甘珀酸,阻断缝隙连接通讯,发现星形胶质细胞细胞的活化减少了,表明缝隙连接的通讯功能增强可以引起星形胶质细胞的活化。结合上边两个实验我们大致可以得出这样一个结论,即在一侧外周神经损伤的情况下,术侧脊髓背角释放更多的谷氨酸,然后通过PKC通路使CX43蛋白磷酸化,增强缝隙连接通讯的功能,使星形胶质细胞通过缝隙连接有术侧活化到对侧,引起镜像痛。本研究将为阐明缝隙连接在神经病理性疼痛中的作用及机制提供新资料,为探寻神经病理性疼痛的防治靶点及药物开发提供重要的实验基础。第一部分：鞘内注射甘珀酸降低CX43的表达对大鼠镜像痛的影响目的：研究大鼠脊髓星形胶质细胞CX43的表达变化及对镜像痛的影响。方法：96只SD大鼠随机分为四组,Sham组,SNI组,SNI+NS组,SNI+CBX组,每组24只。各组分别于术前1d术后3、7、10、14、21d观察大鼠疼痛行为学变化,其中Sham组,SNI组于术后14d采用免疫组化法分析缝隙连接蛋白43(Cx43)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况；SNI+CBX组于术后第5至第9天鞘内注射甘珀酸10μL(20μg),SNI+NS组注射等量生理盐水,并与术后10、14、21d三个时间点采用Westernblot的方法检测脊髓内CX43蛋白表达情况,采用免疫组化法分析GFAP的表达变化情况。结果：SNI组与Sham组相比,行为学上大鼠双侧机械缩足阈值降低,脊髓星形胶质细胞CX43及GFAP表达增加(P<0.05); SNI+CBX组与SNI+NS组相比,Westernblot显示CX43表达降低,免疫组化显示脊髓背角双侧GFAP表达降低(P<0.05),术后14d,21d大鼠双侧机械缩足阈值升高。结论：鞘内注射甘珀酸降低了CX43的表达可抑制星形胶质细胞的活化,并缓解大鼠双侧后肢的机械痛。第二部分：谷氨酸增强缝隙连接通讯功能对星形胶质细胞活化的影响目的：通过离体培养脊髓星形胶质细胞,探讨谷氨酸对缝隙连接通讯功能的调控作用及对星形胶质细胞的活化机制。方法：实验分为正常对照组、谷氨酸刺激组(10μmkl/L谷氨酸作用24h)、PKC抑制剂组及CBX阻断组(20μmol/L甘珀酸作用24h)。western blotting法检测各组星形胶质细胞中p-Cx43、p-PKC、GFAP、P-ERK蛋白的表达；细胞免疫荧光法检测各组星形胶质细胞P-Cx43胞膜蛋白的表达及GFAP蛋白的表达；划痕标记染料示踪技术检测各组星形胶质细胞的缝隙连接通讯功能。结果：谷氨酸刺激组与正常对照组相比,星形胶质细胞p-Cx43、p-PKC、GFAP蛋白的表达增加,细胞缝隙连接通讯功能增强(P<0.01)；在谷氨酸刺激的基础上给予pkc抑制剂作用后p-Cx43、GFAP蛋白的表达降低,细胞缝隙连接通讯功能减弱(P<0.01)；给予缝隙连接阻断剂CBX后,星形胶质细胞GFAP蛋白表达降低(P<0.01)。结论：谷氨酸可以通过PKC通路使CX43的磷酸化增加,进而增强其缝隙连接通讯的功能,进一步活化星形胶质细胞的活性。