论文摘要
背景与目的马尾松松针为松科植物针形叶，近年来研究发现其富含黄酮类物质、木脂类、维生素、多糖类和微量元素等天然抗氧化活性物质，且无毒，无副作用，可作为天然抗氧化剂和抗氧化功能食品的良好来源。目前对马尾松松针抗氧化活性的研究，主要集中在推测可能具有某种抗氧化活性组分的提取分离和功能评价等方面，而以“抗氧化活性”为质量控制目标，从马尾松松针物质中筛选出具有抗氧化活性成分的研究尚未见报道。因此，本研究拟以马尾松松针为原料，以总抗氧化能力为质量控制目标，深入研究马尾松松针抗氧化活性以及研制抗氧化功能饮料，为开发利用马尾松松针资源，以及研制新型天然抗氧化产品提供科学依据。本课题组前期研究了马尾松松针抗氧化活性成分的提取、分离、纯化和组分分析方法，以及对马尾松松针抗氧化提取液进行抗疲劳活性功能评价。在此基础上，本研究拟从提取分离方法加以改进和完善，并对马尾松松针抗氧化提取液进行抗氧化功能评价，以明确其抗氧化功能，同时进一步研制马尾松松针系列功能饮料，为开发利用马尾松松针资源，以及研制新型天然抗氧化产品提供科学依据。方法1、提取工艺单因素试验中，除了考察料液比、时间和温度对提取效果的影响，加入提取溶剂作为考察因素，并在单因素结果的基础上选取各因素较优的三个水平进行正交试验，优选出最佳提取工艺条件。2、分离纯化采用柱层析法，选择大孔吸附树脂为柱填料对总抗氧化能力最高的提取液进一步分离纯化。通过静态吸附与解吸试验，从NKA-9、AB-8、D101这几种极性不同的大孔吸附树脂中筛选出适合分离纯化马尾松松针抗氧化活性成分的填料，并经过分级洗脱，评价各洗脱部分的总抗氧化能力，选择总抗氧化能力最强的洗脱部位进行下一步的抗氧化功能评价。3、抗氧化功能评价结合体外实验和体内试验综合评价马尾松松针纯化液的抗氧化功能。体外试验检测指标主要包括总抗氧化能力、羟自由基清除能力和超氧阴离子清除能力。体内试验参照《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）中的抗氧化功能评价方法进行动物实验，取血检测血清过氧化脂质物质丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）活力、过氧化氢酶(CAT)活力。4、成分分析将明确具有抗氧化功能的纯化液进行紫外-可见光扫描初步鉴定抗氧化活性成分，然后采用化学定性分析法加以佐证或排除，最后根据高效液相色谱-质谱法得到的化合物保留时间、分子量及碎片离子峰等信息，并结合数据库和文献资料分析马尾松松针中的抗氧化活性成分。5、抗氧化功能饮料研制以松针、绿茶为主要原料，通过单因素试验、正交试验和感官评价确定最佳浸提工艺及饮料配方，研制具有抗氧化活性的松针绿茶复合饮料。结果1、提取工艺通过单因素分析和正交试验，得到马尾松松针抗氧化活性成分的最优提取工艺为:提取溶剂为0%乙醇（即超纯水），料液比为1:40，提取温度80℃，提取时间90分钟。通过验证试验表明在最优工艺条件下提取液的总抗氧化能力为183.293U/ml,与前期研究的结果相当。同时验证了在本课题组的工艺研究中，水是最佳的提取溶剂。2、分离纯化与AB-8、D101大孔树脂相比，NKA-9大孔吸附树脂最适合用于分离纯化马尾松松针抗氧化活性成分。通过对上样量、洗脱剂浓度、洗脱剂流速和洗脱剂用量的考察，确定了NKA-9大孔吸附树脂柱层析分离纯化马尾松松针抗氧化活性成分的条件为：上样量9BV，洗脱剂为40%乙醇，洗脱流速3BV/h，洗脱体积3BV。通过高效液相色谱分析，本研究纯化后得到的马尾松松针提取液比纯化前，以及本课题组前期研究得到的纯化液的杂质少，纯化效果较好。3、抗氧化功能评价纯化后的马尾松松针抗氧化成分PNPM-2的总抗氧化能力、清除羟自由基和超氧阴离子的能力均比纯化前的马尾松松针抗氧化成分PNPM-1强，且PNPM-2与同质量浓度Vc进行对照实验表明，总抗氧化能力相接近，羟自由基清除能力略低于Vc，但清除超氧阴离子自由基的能力在低浓度时明显高于Vc。体内抗氧化实验中，与模型组相比，马尾松松针抗氧化成分和Vc均可降低小鼠血清MDA含量，提高小鼠血清SOD、GSH-Px及CAT活力水平，差异具有统计学意义，且马尾松松针抗氧化成分PNPM-2随着质量浓度的增大，抗氧化功效越显著。4、成分分析利用LC-MS，结合化学显色鉴定、紫外-可见波谱进行分析，并充分利用质谱数据库和文献数据初步推出马尾松松针中的抗氧化活性成分是儿茶素，与前期结果基本一致，同属于黄酮类物质。5、抗氧化功能饮料最佳配方在松针与绿茶（g:g）配比为1:1，料水比（g:ml）为1:80，提取时间为30分钟，浸提温度为90℃；白砂糖添加量为3%，柠檬酸添加量为0.01%，蜂蜜添加量为0.1%参数下研制的松针绿茶复合茶饮料不仅具有独特的松针和绿茶香味，口感宜人且具有较强抗氧化活性，其中总抗氧化能力为149.492U/ml，羟自由基清除能力为27.860U/ml，茶多酚含量为1941.183mg/kg。结论1、优化提取工艺，并经NKA-9大孔吸附树脂分离纯化后得到了更高活性和纯度的马尾松松针纯化液。2、对马尾松松针纯化液进行抗氧化功能评价及成分分析，初步鉴定了具有显著抗氧化效果的活性组分主要为儿茶素。3、以马尾松松针、绿茶为主要原料，通过单因素试验、正交试验和感官评价确定最佳浸提工艺及饮料配方，研制出的松针绿茶复合茶饮料不仅具有独特的松针和绿茶香味，口感宜人且具有较强抗氧化活性。