论文摘要
职业接触三氯乙烯(trichloroethylene, TCE)所导致的药疹样皮炎是我国近年来严重危害作业工人健康的职业病。该病以严重的皮肤粘膜损伤为特征,常伴有发热、淋巴结肿大和肝肾功能损伤。职业性药疹样皮炎发病机制不清,到目前为止尚缺乏特异性的预防和治疗方法。基质金属蛋白酶(matrix metaloproteases, MMPs)及其组织抑制剂(tissue inhitors of metaloproteases, TIMPs)在皮疹等炎症性皮肤性疾病的发生、发展过程中发挥重要作用；在痊愈的TCE药疹样皮炎患者进行的皮肤斑贴试验提示TCE氧化代谢通路的代谢产物在TCE药疹样皮炎的发病过程的发挥重要作用。基于此,该论文第一部分研究TCE氧化代谢通路的两种主要代谢产物三氯乙醇(tricloroethanol, TCOH)和三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)对永生化表皮角质形成细胞(HaCaT) MMPs和TIMPs表达的影响。本课题组前期基于TCE接触职业人群的病例-对照研究发现：人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)-B*1301与TCE药疹样皮炎的发病易感性存在强关联,提示HLA-B*1301分子在该病发病过程中发挥重要作用。该课题第二部分研究HLA-B*301及HLA-B*1302基因克隆、C1R-B*1301和C1R-B*1302细胞系构建和HLA-B蛋白纯化及结合抗原肽分离纯化,探索HLA-B*1301提呈抗原肽在HLA-B*1301与TCE药疹样皮炎易感性关联中的分子基础。一.TCOH或TCA对HaCaT细胞MMPs和TIMPs表达及活性影响应用不同浓度的TCOH (0,0.25,0.50,1.0,2.5,5.0mM)或TCA(0,0.25,0.50,1.0,2.5,5.0mM)处理HaCaT细胞24h、48h、72h、96h、120h、144h,应用底物-明胶酶谱法测定了TCOH或TCA对HaCaT细胞MMP-2和MMP-9酶活性的影响(24-72h)；应用实时定量PCR方法测定了TCOH或TCA对HaCaT细胞MMP2、MMP9、TIMP1及TIMP2基因转录的影响；应用Western-blotting测定了TCOH对HaCaT细胞MMP-9及TIMP-1蛋白表达的影响。结果发现,TCOH处理HaCaT细胞后,MMP-9mRNA和蛋白表达水平显著提高,明胶酶活性明显增强,存在明显剂量-效应关系；TCOH同时诱导HaCaT细胞TIMP-1mRNA及蛋白表达水平显著提高,存在明显剂量-效应关系。TCA处理HaCaT细胞后,未发现对MMP-2及MMP-9mRNA或明胶酶活性发生显著影响,对TIMP-1和TIMP-2mRNA表达水平也为发生显著影响。结果提示TCOH可能通过诱导皮肤角质形成细胞MMP-9及其抑制剂TIMP-1表达改变,从而在TCE药疹样皮炎发生或发病过程中发挥重要作用。二.C1R-B*1301和C1R-B*1302细胞系构建和HLA-B*1301和C1R-B*1302蛋白纯化、HLA-B*1301/1302提呈抗原肽比较研究应用HLA-B基因座位序列特异性引物,扩增了一例携带有HLA-B*1301的三氯乙烯药疹样皮炎患者的cDNA,通过基因重组技术,将HLA-B*1301cDNA克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体；应用定点突变技术,将pcDNA3.1-B*1301定点突变为pcDNA-B*1302；应用Lipofectin脂质体介导的转染方法,将pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1一B*1301FLAG和pcDNA3.1-B*1302FLAG导入C1R细胞,构建了C1R-V、C1R-B*1301和C1R-B*1302细胞；应用交联有W6/32(小鼠抗人HLA-ABC单克隆抗体)的protein A Sepharose CL-4B基质为基础的免疫亲和层析技术,分离纯化了HLA-B*1301和HLA-B*1302,通过离心超滤技术将HLA-B*1301和HLA-B*1302结合抗原肽分离。分离的抗原肽经反相高效液相色谱-串联质谱分析发现：与HLA-B*1302提呈抗原肽序列比较,HLA-B*1301提呈抗原肽在主要锚着残基位点(P2和P9)与HLA-B*1302明显不一致,HLA-B*1301在P2位点的优先氨基酸为赖氨酸和谷氨酰胺,在P9的优先氨基酸残基为赖氨酸、谷氨酸和异亮氨酸；而HLA-B*1302在P2位点的优先氨基酸为亮氨酸和丝氨酸,在P9位点的优先氨基酸为赖氨酸和缬氨酸。此外在非主要锚着位点,两者之间也存在很大差异。提示HLA-B*1301与职业性三氯乙烯药疹样皮炎强关联而HLA-B*1301与该病易感性不存在关联的分子机制可能是因为两者所提呈的抗原肽的主要锚着残基和非主要锚着残基位点的优先氨基酸存在很大差异,引起所提呈的肽差别很大。但通过比较HLA-B*1301提呈抗原肽和其它已发表的HLA-B类分子所提呈的抗原肽序列,发现在主要锚着位点优先氨基酸没有显著差异,提示HLA-B*1301与三氯乙烯药疹样皮炎的强关联可能是通过主要锚着位点和非主要锚着位点的联合作用而发挥效应的。综上所述,本研究探讨了TCE两种代谢TCOH和TCA对HaCaT皮肤角质形成细胞MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2表达或活性的影响,发现TCOH能以剂量-效应方式诱导MMP-9及TIMP-1表达增强,提示TCOH可能在TCE皮肤过敏反应过程中发挥重要作用；构建了高表达HLA-B*1301及HLA-B*1302的C1R-B*1301和C1R-B*1302细胞,建立了分离纯化HLA B分子及HLA I类分子结合抗原的方法,比较HLA-B*1301和HLA-B*1302提呈抗原肽的特征发现两者所提呈的抗原肽在主要锚着位点和非主要锚着位点存在极大差异,初步解释了HLA-B*1301与职业性三氯乙烯药疹样皮炎之间强关联的分子基础。