论文摘要
ALI/ARDS在20世纪60年代首次被公认为一种临床综合症，表现为低氧血症、双肺浸润的严重急性呼吸衰竭。引起ALI/ARDS的病因复杂，其中弥漫性肺部感染特别是革兰氏阴性杆菌感染为最主要原因，而内毒素（LPS）正是革兰氏阴性杆菌感染的主要致病因素。ALI/ARDS当前的治疗方案主要是支持治疗，给予肺保护性通气以及药物保守治疗，而迄今为止的临床试验所评价的大批治疗药物并没有哪一种被证实是有效的，ALI/ARDS的死亡率仍高达40%。因此，创新的治疗手段对于ALI/ARDS是十分必要的。干细胞目前已经成为国内外研究的热点，间充质干细胞(mesenchymal stemcells，MSC)因为其良好的安全性，目前已经成为临床研究和应用的主要细胞来源。因此，本研究首先构建内毒素诱导的急性肺损伤模型，并获取人脐带来源的间充质干细胞，拟探讨人脐带间充质干细胞对内毒素诱导的急性肺损伤的治疗作用、实际应用研究、与临床常用药物的治疗比较以及可能的治疗机理。因此，我们制定了如下的实验内容及方法：一、构建内毒素诱导急性肺损伤模型：8-10周龄雌性C57BL/6小鼠，经气管内给予LPS10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg剂量，分别观察不同剂量下死亡率及肺部病理损伤。二、获取无异种蛋白可临床级应用的人脐带来源的间充质干细胞：取新鲜脐带组织，清洗、消化获得间充质干细胞，用无血清培养基进行原代培养，经传代扩增后进行表面标记鉴定及分化鉴定，获得符合间充质干细胞生物特性的细胞。三、人脐带间充质干细胞（hUC-MSC）治疗急性肺损伤的应用及与甲强龙的治疗比较：1.小鼠内毒素诱导急性肺损伤模型造模成功后，给予小鼠尾静脉移植hUC-MSC2×105，通过不同移植时间(0.5h、4h、24h)确定细胞移植有效时间窗。2.给予半数致死剂量LPS诱导小鼠内毒素急性肺损伤模型，随后给予小鼠不同剂量hUC-MSC（2×105、5×105、1×106）尾静脉移植，以得出最佳细胞移植剂量。3.hUC-MSC与甲强龙治疗急性肺损伤的比较研究：通过病理损伤（损伤评分）、肺组织湿干重比（W/D）、BALF中总细胞数及中性粒细胞数、BALF总蛋白含量（BCA法）、BALF细胞因子含量（CBA法）、全肺细胞组分流式分析等指标比较细胞与药物治疗的效果。经过实验我们成功构建了气管内注射LPS诱导的急性肺损伤模型，模型建立容易，肺损伤程度稳定，符合临床上感染性急性肺损伤的病理生理改变。通过给予LPS剂量的增加，小鼠死亡率及肺部病理损伤评分均相应增加，且数值稳定、均一，由此可根据对动物死亡率及肺部病理损伤程度的不同要求设计相应实验。我们的实验结果提示，胶原酶消化获得hUC-MSC单个细胞，通过人间充质无血清培养基培养原代后，细胞数量得到倍数扩增，并经多次传代后，细胞纯度提高，形态稳定均一，仍具有MSC典型成纤维样、长梭形、旋涡状生长特点及无限扩增能力。培养至P4代细胞表面不同特异抗原仍具有稳定表达，高表达MSC细胞特异标志CD44、CD73、CD90、CD105及HLA-ABC，不表达造血细胞表面标志CD14、CD34、CD45及不表达内皮细胞标志HLA-DR。通过体外特异培养基诱导hUC-MSC分化成骨、成脂，结果提示我们的hUC-MSC在P4代仍具有较强的分化能力。从形态、表面标志抗原及分化能力等不同结果分析，实验获得的hUC-MSC具有成体间充质干细胞生物学特性。进一步研究我们发现，小鼠内毒素诱导急性肺损伤模型造模成功后，分别于0.5h、4h、24h给予2×105hUC-MSC尾静脉移植，48h后观察实验动物病理损伤程度。结果显示在致伤后0.5小时、4小时及24小时给予人脐带间充质干细胞2×105尾静脉移植治疗均可减轻内毒素诱导的肺组织病理损伤，说明致伤后0.5h-24h均为有效治疗时间。而当给予半数致死剂量LPS造模后，分别给予PBS以及不同剂量hUC-MSC（2×105、5×105、1×106）尾静脉移植，48h后观察实验动物死亡率及病理损伤程度。实验结果显示在同等造模剂量并同时给予细胞移植情况下，hUC-MSC2x105剂量下对于小鼠有保护作用，肺部组织病理损伤明显减轻，小鼠死亡率降低，对于急性肺损伤有明显的治疗效果，而随着hUC-MSC移植剂量的增大，保护效果逐渐减弱，病理损伤评分增加，甚至增加了死亡率。小鼠内毒素诱导急性肺损伤模型造模成功后，于造模后24h分别给予PBS、hUC-MSC、甲强龙(Drug)、hUC-MSC+甲强龙(hUC-MSC+Drug)尾静脉移植治疗。48h后观察实验动物病理损伤程度，可见小鼠致伤后给予hUC-MSC、甲强龙以及hUC-MSC与甲强龙联合治疗均有效减轻了肺组织病理损伤。从损伤评分来看，hUCMSC与甲强龙联合治疗效果最好，损伤评分最低，但是与单独应用hUCMSC或甲强龙组比较并无统计学差异，其效果并未优于其他两组。小鼠致伤后给予hUC-MSC、甲强龙以及hUC-MSC与甲强龙联合治疗，各治疗组肺组织湿干重比均较PBS对照组有所下降，hUC-MSC组与联合治疗组均有显著差异，甲强龙治疗组湿干重比与PBS对照组比略低，但未达到统计学差异。小鼠内毒素诱导急性肺损伤后给予hUC-MSC、甲强龙以及hUC-MSC与甲强龙联合治疗，与PBS对照组相比，各治疗组BALF细胞总数、中性粒细胞百分比及中性粒细胞数均明显下降，有显著性差异，说明各组治疗均可减轻内毒素诱导急性肺损伤的炎症反应。各治疗组BALF中总蛋白含量明显降低，其中甲强龙+hUC-MSC组总蛋白含量最低，hUC-MSC组次之，甲强龙组略高，但三组之间比较无统计学差异。肺损伤后给予hUC-MSC、甲强龙、甲强龙+hUC-MSC各组治疗后，BALF中TNF、IL-6含量明显降低，IFN-γ、IL-10、MCP-1、IL-12无明显变化，在三组治疗中，联合治疗组并未比单独应用hUC-MSC或甲强龙在炎症因子调节方面取得更好效果。肺损伤后给予PBS、hUC-MSC、甲强龙治疗，观察2d、7d、14d、28d各时间点CD45-CD31+细胞群（内皮细胞）、CD45+细胞群（白细胞）、CD31-CD45-EpCAM+细胞群（上皮细胞）、CD31-CD45-EpCAM-Sca1+细胞群（间质细胞）、CD31-CD45-CD24lowEpCAMhi细胞群（上皮干祖细胞）各群细胞组分变化。结果表明，与PBS组比较，2d时甲强龙组CD45+细胞群（白细胞）显著减少，而hUC-MSC组并不引起任何细胞组分变化；除CD45+群细胞外，其他各群细胞均无明显改变，且7d、14d、28d各治疗组各群细胞亦区别不大，由此考虑药物治疗的部分机制为通过降低了CD45+细胞群（白细胞）而减轻炎症反应，而hUC-MSC的治疗则并非通过改变细胞组分而起效。基于以上动物模型及实验方法，除了主要进行的hUC-MSC治疗急性肺损伤的研究外，同时还与天津医科大学谢克亮博士共同进行了NO和H2治疗急性肺损伤的部分研究。由此我们得出如下结论：一、成功构建了稳定的小鼠内毒素急性肺损伤模型二、成功获得了无异种蛋白的人脐带来源间充质干细胞，大大降低了细胞免疫原性，对未来临床及组织工程等多方面应用提供了更有利的基础及安全保障。三、1.从临床实际应用出发，摸索了急性肺损伤的有效治疗时间窗及最佳细胞移植剂量，在内毒素急性肺损伤的治疗方面目前尚无同类研究；2.在内毒素诱导急性肺损伤的治疗相关研究中，明确了人脐带间充质干细胞治疗急性肺损伤有显著效果，并首次将细胞治疗与目前临床常用药物甲强龙做比较，二者治疗急性肺损伤均有显著疗效，但疗效比较并无差异，且二者联用并无协同作用，此方面研究目前尚无相关报道。3.在急性肺损伤的治疗研究中，首次利用流式细胞技术分析各治疗组全肺细胞组分，明确了hUC-MSC对急性肺损伤的治疗作用并非通过改变细胞成分而起作用，为今后关于间充质干细胞治疗急性肺损伤的机制研究奠定了基础。四、2%H2或/和0.004%NO通过减少炎症和细胞凋亡明显减轻内毒素诱导的急性肺损伤，这可能与NF-κB活性下降相关。