论文摘要
阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）是一种严重危害老年人健康的神经退行性疾病，主要表现为认知功能进行性衰退，同时伴有行为及精神异常。AD的三大病理特征主要包括：老年斑（Senile Plaques，SPs）、神经原纤维缠结（Neurofibrillary Tangles，NFTs）和神经元丢失（neuro loss）。AD的发病机制迄今尚不十分清楚，亦无有效的防治药物问世。目前，FDA批准用于AD治疗的药物，如胆碱脂酶抑制剂（Cholinesterase Inhibitors，ChEIs）和NMDA受体（N-methyld-D-aspartate Receptor，NMDAR）拮抗剂，只能在一定程度上改善症状，而不能延缓或阻断疾病的进展。AD的发病机制假说众多，包括基因学说、传染学说、炎症学说、胆碱能学说、铝中毒学说、自由基学说、钙超载学说、Tau蛋白学说、代谢紊乱学说、β-淀粉样蛋白（β-Amyloid,Aβ）级联假说等。其中Aβ级联假说是现在最为公认的AD发病机制之一。该假说认为，Aβ异常聚集是Aβ级联通路的关键环节，而Aβ代谢通路也是开发AD治疗药物最受关注的靶点。据2010年Lancet报道，目前研究开发的AD防治药物中约66%是针对Aβ及其代谢通路的，而抗Aβ聚集又是其中最为重要的研究方向之一。研究表明，影响Aβ聚集的因素很多，如Aβ的浓度、溶剂pH值和金属离子等，其中金属离子对Aβ聚集的影响近年来受到广泛关注。金属离子螯合剂氯碘羟喹（CQ）及其类似物PBT2在动物水平及临床试验中也表现出良好的疗效。因此，本课题对金属离子螯合剂HYF系列化合物和系列天然产物进行筛选，考察其是否具有抗Aβ自身聚集及金属离子Zn2+诱导的聚集的作用，并在分子水平、细胞水平和动物水平对活性化合物进行活性评价，旨在为基于抗Aβ聚集的AD防治药物研究开发奠定基础。一、体外分子水平抗Aβ聚集化合物筛选方法的建立和优化由于浊度法及Th-T结合实验法被广泛用于体外Aβ聚集的研究，但两种方法均存在一定的不足，因此本研究通过对两种方法进行条件摸索及优化，建立一种高通量、高稳定性的可定量的筛选方法。1.浊度法浊度法是基于溶液中颗粒的多少与405nm的吸光度值成正比，因此通过检测Aβ的OD405可反映其聚集量的多少。本研究首先考察了不同浓度Aβ25-35及Aβ1-42聚集过程中浊度的变化情况，结果表明不同浓度的Aβ25-35或Aβ1-42的OD405值介于0.046与0.058之间，组间差别较小，并且在48小时内变化不明显。由于药物筛选需要较大的检测窗口，因此浊度法不适合本课题的药物筛选。2.硫磺素T（Thioflavin T, Th-T）结合实验Th-T能特异性地与淀粉样纤维结合，并且在450nm的激发光（Excitation，Ex）照射下，分子由激发态向基态漂移可在485nm检测到强的发射波（Emission，Em），并且该发射波的荧光信号强弱与所形成的淀粉样纤维的量成正比。研究中常采用分光光度法进行Th-T结合实验的荧光定量，而酶标仪和荧光分光光度计是被广泛使用的定量仪器。本研究首先使用具有较高通量的多功能酶标仪考察了10μM Aβ1-42的聚集随时间的变化。结果表明Aβ1-42荧光强度随孵育时间增加而升高，但7h后复孔间差异变大，且同一样品重复检测也有较大差异。Aβ1-42聚集随时间增加，聚集斑块增大，造成体系不均一，这可能是酶标仪检测不稳定的主要原因。所以，Th-T结合实验中酶标仪检测得到的的荧光强度可能不能反映Aβ1-42聚集的真实情况。聚集态Aβ与Th-T结合后在荧光显微镜下可见，因此我们采用具有图像分析和定量功能的高速细胞分析仪（Acumen）对Aβ1-42聚集情况进行图像采集和定量分析。结果表明，Aβ1-42的聚集斑块数目及大小随浓度（2.5-40μM）增加而增多、增大；荧光定量结果表明，Aβ1-42的荧光强度随其浓度增加而增大，并且在Aβ1-42的浓度小于10μM时，荧光强度与浓度呈较好的线性关系（R2=0.99997），而当浓度继续升高时，失去其线性关系。该结果提示，当Aβ1-42浓度小于10μM时，其荧光强度能较好的反映其聚集程度。所以，本研究选用10μMAβ1-42进行后续实验。在对Aβ1-42聚集的影响的考察中发现，Aβ1-42的聚集斑块数目及大小随时间增多、增大；荧光定量结果显示与文献报道一致，Aβ1-42的荧光强度随时间增加，且在孵育12h后达到平台，24h趋于稳定。因此，该结果提示，Aβ1-42在37℃条件下孵育24h可聚集到最大程度。为了进一步验证图像分析法在Th-T结合实验中的应用，我们还使用已报道具有抗Zn2+诱导的Aβ1-42聚集作用的金属离子螯合剂氯碘羟喹（Clioquinol，CQ）对所建立的方法进行验证。结果显示，与文献报道一致CQ能显著性降低Zn2+诱导的Aβ1-42的聚集。另外，图像分析法还能对聚集物的特点进行分析，并达到通过参数限制特异性地去除实验体系中引入的杂质，以排除其对总荧光强度的影响，进而提高方法的准确性。此外，作为一款高速的细胞图像分析仪，Acumen可在数分钟内完成图像扫描和分析。所以，基于高速图像分析系统的图像分析法是进行Aβ体外聚集状态分析的良好方案。小结：通过以上研究，我们建立了一种基于图像分析的、高通量的、高准确性的可定量检测的Aβ1-42聚集的实验方法，为后续的化合物筛选奠定了良好的基础。二、抗Aβ1-42聚集化合物的筛选及分子水平的评价由于Aβ1-42可自发聚集，亦可在金属离子的诱导下聚集，因此本研究使用以上建立的基于图像分析的荧光定量方法对金属离子螯合剂HYF系列化合物（药物合成实验室提供）(40μM)及系列天然产物(40μM，当天然产物为混合物时采用40μg/mL的浓度)共19种化合物进行筛选，以期获得具有抗Aβ1-42(10μM)聚集作用的化合物，并进一步在分子水平考察活性化合物的作用特点，研究中使用CQ作为阳性对照。1.化合物的筛选HYF系列化合物的筛选结果表明，LL4-3-Ⅱ仅能显著性降低20μM Zn2+诱导的Aβ1-42聚集的荧光强度，而其余各化合物均能显著性地降低Aβ1-42自发聚集及20μM Zn2+诱导聚集的荧光强度。系列天然产物筛选结果表明，C1900、BSG、JSD-3、A102均可降低Aβ1-42的自发聚集及20μM Zn2+诱导聚集的荧光强度。图像分析结果亦表明，加入以上具有抗Aβ1-42聚集的药物后，镜下聚集体数目减少，而倒置荧光显微镜下采用相同的曝光条件进行曝光，也可发现加入这些化合物后Aβ1-42的荧光强度明显降低。本实验室前期研究结果表明，HYF系列化合物中仅HYF118C具有较低的细胞毒性，而BSG及JSD-3为混合物，因此以下主要对HYF118C、C1900及A102进行研究。2.假阳性结果排除为了排除Th-T结合实验中化合物本身在450nm或485nm的强吸收造成假阳性结果，我们对各化合物进行了300-600nm的全波长扫描。结果发现A102在450nm附近有吸收，提示A102对Aβ1-42的作用可能为假性结果，而CQ、HYF118C、C1900则未因自身的光谱学性质造成假阳性结果。此外化合物还可能通过竞争Th-T与Aβ1-42聚集后的结合位点而造成假阳性结果，因此我们采用竞争实验观察了CQ、HYF118C、C1900对Th-T结合位点的影响，结果发现CQ、HYF118C、C1900与Th-T在Aβ1-42聚集后的结合位点无竞争关系。小结：通过以上抗Aβ1-42聚集活性的筛选及可能存在的假阳性结果的排除，确定HYF118C及C1900在分子水平具有显著地抗Aβ1-42聚集的活性，可进行后续研究。3.活性化合物分子水平的评价3.1活性化合物抑制Aβ1-42聚集的量效考察首先考察了三种化合物抗Aβ1-42自身聚集及Zn2+诱导的Aβ1-42聚集的影响。结果表明，CQ抑制Aβ1-42聚集及Zn2+诱导的Aβ1-42聚集的IC50分别为6.1和4.3μM，二者无明显差异；HYF118C和C1900抑制Aβ1-42聚集的IC50分别为22.4和18.6μM，以及抑制Zn2+诱导的Aβ1-42聚集的IC50分别为14.8和17.3μM。结果表明，CQ、HYF118C、C1900对Aβ1-42自身聚集及Zn2+诱导的Aβ1-42聚集均具有明显抑制作用，HYF118C及C1900抑制Aβ1-42聚集的作用稍弱于CQ。进而，本研究还考察了三种化合物对聚集态Aβ1-42的解聚作用。结果显示，CQ解聚Aβ1-42自身聚集形成的聚集态Aβ1-42及Zn2+诱导形成的聚集态Aβ1-42的IC50分别为7.5和6.1μM，二者无明显差别；HYF118C及C1900解聚Aβ1-42自身聚集和Zn2+诱导形成的聚集态Aβ1-42的IC50分别为18.7和14.7μM，及8.7和9.5μM。以上结果提示三种化合物对Aβ1-42自身聚集形成的聚集态Aβ1-42和Zn2+诱导形成的聚集态Aβ1-42均具有解聚作用，C1900解聚聚集态Aβ1-42的作用强度与CQ基本相当，而HYF118C的作用强度稍弱。3.2圆二色谱法考察活性化合对Aβ1-42聚集二级结构的影响在以上研究的基础上我们采用圆二色谱法考察了Aβ1-42聚集中二级结构的变化及三种化合物（CQ、HYF118C、C1900）对Aβ1-42聚集中二级结构的影响，结果显示，在浓度小于80μM是Aβ1-42聚集中β-折叠的形成与浓度成正比，且孵育24h后β-折叠的形成基本稳定。化合物CQ、HYF118C、C1900（240μM）对Aβ1-42（60μM）二级结构的影响结果表明，CQ可明显减少Aβ1-42聚集中β-折叠的形成，而HYF118C及C1900对其二级结构无明显影响。3.3透射电子显微镜考察活性化合物对Aβ1-42聚集超微结构的影响透射电子显微镜观察结果表明，三种化合物（CQ、HYF118C、C1900）（40μM）均可明显改变Zn2+诱导的Aβ1-42聚集的超微结构，并使聚集体更松散，分子间的交联更少。小结：对化合物CQ、HYF118C、C1900抗Aβ1-42聚集进行分子水平评价，结果表明，三者均能浓度依赖性地抑制Aβ1-42的聚集，亦能浓度依赖性解聚聚集态的Aβ1-42，Zn2+对以上作用无明显影响，仅CQ可显著性降低Aβ1-42聚集中β-折叠的形成，三者均能有效地降低Aβ1-42聚集中所形成的交联，使聚集更松散。三、活性化合物的生物学活性评价分子水平的筛选和评价已证明CQ、HYF118C、C1900具有抗Aβ1-42聚集的活性，为了进一步研究其与Aβ相关的生物学活性，本研究进一步考察活性化合物对Aβ1-42致细胞损伤的作用，并在以Aβ沉积为主要特点的APP/PS1双转AD模型小鼠及快速老化小鼠P8亚系（Senescence-accelerated Mouse Prone8,SAMP8）模型动物上进行其药效学评价。1.活性化合物对Aβ1-42致细胞损伤的作用研究中使用CCK-8法检测OD450来观察细胞的活力，采用倒置荧光显微镜观察细胞状态。首先观察化合物CQ、HYF118C、C1900本身对SH-SY5Y细胞存活的影响，结果表明仅10μM CQ对SH-SY5Y细胞具有轻微的损伤作用，而在浓度<10μM时C1900及HYF118C对SH-SY5Y细胞无明显作用。进而观察不同浓度的CQ、HYF118C、C1900对Aβ1-42所致SH-SY5Y细胞损伤的作用，结果表明，（40μMAβ1-42可使SH-SY5Y细胞的活力降低至溶剂对照组的50%，5μM及10μM的HYF118C和C1900均能明显提高Aβ1-42作用12h和24h细胞的活力，而CQ仅对Aβ1-42作用24h的细胞有明显的保护作用。倒置荧光显微镜下观察的结果也表明，Aβ1-42模型组细胞受损明显，活性化合物对Aβ1-42致细胞损伤具有明显保护作用。上述结果表明，CQ、HYF118C、C1900对Aβ1-42致细胞损伤均具有明显保护作用。2.活性化合物的动物水平药效学评价2.1对APP/PS1小鼠学习记忆行为、筑巢行为及神经突触可塑性的影响选择13-14月龄APP/PS1小鼠，灌胃给予CQ（30mg/kg/d）或C1900（100mg/kg/d）11天，通过筑巢实验（Nest Construction test）、自主活动（LocomotorActivities）、新物体识别（Object Recognition Test, ORT）、跳台实验（Step DownTest）、Morris水迷宫（Morris Water Maze, MWM）及在体海马长时程增强（Long-term Potentiation，LTP）实验观察药物对小鼠学习记忆行为、筑巢行为及神经突触可塑性的影响。结果表明，给药期间小鼠体重没有明显的变化，行为学评价结果显示，C1900可明显改善小鼠的筑巢行为，缩短Morris水迷宫定向航行实验小鼠寻找站台的潜伏期，CQ也对小鼠寻找站台的时间有明显的缩短作用。C1900和CQ对其它行为学指标无明显影响。此外，APP/PS1小鼠海马在体LTP实验结果表明，C1900可提高小鼠海马CA1区高频刺激诱导的群峰电位增幅，使输入-输出（nput-Output，I-O）曲线明显左移，而CQ对APP/PS1小鼠LTP无明显影响，提示C1900可显著性改善APP/PS1小鼠的神经突触可塑性。2.2对SAMP8小鼠学习记忆行为、筑巢行为及神经突触可塑性的影响此外，本研究还考察了CQ（30mg/kg/d）、HYF118C（30mg/kg/d）及C1900（100mg/kg/d）对SAMP8小鼠筑巢行为、学习记忆行为及神经突触可塑性的影响。结果表明，三个化合物对小鼠体重均无明显影响，对小鼠的筑巢行为及学习记忆行亦无明显的改善作用，仅C1900对小鼠在体海马LTP具有明显增强作用，提示C1900对SAMP8的神经突触可塑性有明显的改善作用。小结：以上研究表明，CQ、HYF118C及C1900对Aβ1-42致细胞损伤具有保护作用，C1900可显著改善APP/PS1小鼠的筑巢行为及Morris水迷宫学习记忆行为，且可APP/PS1小鼠和SAMP8小鼠的神经突触可塑性，提示C1900作为抗AD药物可能具有一定的研究和开发前景。四、结论1.建立了一种基于图像分析的高通量、稳定可靠的定量分析Aβ聚集的方法。2. CQ、HYF118C和C1900均具有抗Aβ1-42聚集的作用，并且Zn2+对该作用无明显影响；CQ还可明显减少Aβ1-42聚集中β-折叠的形成。3. HYF118及C1900对Aβ1-42致SH-SY5Y细胞损伤均具有保护作用。4. C1900可显著改善APP/PS1小鼠筑巢行为和学习记忆行为，并可明显改善APP/PS1小鼠及SAMP8小鼠的神经突触可塑性，具有进一步研究和开发的前景。