论文摘要
目的：以急性早幼粒细胞性白血病细胞株NB4为研究对象,探讨亚砷酸钠(iAsⅢ)及其中间活性代谢产物单甲基亚砷酸(MMAⅢ)、二甲基亚砷酸(DMAⅢ)对NB4细胞的作用,进一步研究其作用机理。方法：常规培养NB4细胞,待细胞稳定后,加入不同浓度的三种砷化合物(1-100μM),24h及72h后,MTT法测定细胞存活率。通过瑞氏-姬姆萨染色法、流式细胞术、western blot和免疫荧光等方法检测不同砷化合物对NB4细胞的分化作用。JC-1染料结合荧光显微镜测定线粒体膜电位变化。Annexin V/PI染料进行流式定量检测细胞凋亡率。Western blot法检测相关蛋白表达。结果：MTT结果显示,三种砷化合物(i.e.,iAsⅢ,MMAⅢ and DMAⅢ)中,二甲基中间代谢产物DMAⅢ对NB4细胞的毒性最大,其次为一甲基中间代谢产物MMAⅢ, iAsⅢ对NB4细胞的毒性最小。瑞氏-姬姆萨染色观察到,iAsⅢ及阳性对照ATRA组可使NB4细胞体积变小,核与浆的比例缩小,核形状由圆形变成不规则,出现肾形、杆状及分叶核,提示细胞出现了分化现象,而其代谢产物MMAⅢ和DMAⅢ对NB4细胞无促进分化作用。MMAⅢ和DMAⅢ处理3天后,观察到典型的凋亡形态学改变,例如胞质中出现空泡、核染色质浓缩、核碎裂等现象。流式细胞术检测CD11b的表达显示,iAsⅢ和ATRA显著增加NB4细胞CDllb的表达,表明,iAsⅢ具有很好的诱导细胞分化作用。另外,我们通过共聚焦显微镜,利用PML及SUMO-1抗体及免疫荧光染色观察了细胞核内的核小体的变化,发现对照组细胞核内PML和SUMO-1呈现弥散而细小的荧光颗粒。iAsⅢ及ATRA处理NB4细胞后,可清晰地观察到现粗大的、PML和SUMO-1融合的荧光颗粒即核小体(NBs)。而MMAⅢ和DMAⅢ处理细胞后,核内则无明显的核体形成,显示MMAⅢ和DMAⅢ对核小体形成没有作用。为了进一步验证三种砷化合物对NB4细胞分化的作用,我们检测了分化相关的蛋白表达变化。Western blot结果显示,iAsⅢ及ATRA有很强的PML-RARα融合蛋白降解作用,相应PRAM-1蛋白表达增高,而MMAⅢ和DMAⅢ对PML-RARα融合蛋白降解无作用。在对比诱导细胞凋亡试验中,Annexin/PI结果显示,对照组细胞的凋亡率为大约13%；iAsⅢ处理NB4细胞24h,细胞凋亡率无显著增加(14%)；相同情况下,MMAⅢ处理24h凋亡率升至40%；加入DMAⅢ24h,凋亡率上调为50%。提示砷的中间代谢产物有很强的诱导细胞凋亡作用。在此基础上,进一步检测了3种砷化合物对凋亡相关的蛋白表达变化。Western blot结果显示,经MMAⅢ和DMAⅢ处理12h后,凋亡相关蛋白Caspase3和PARP活化并出现裂解片段,iAsⅢ处理12h后则无明显变化。同时量效和时效结果提示我们,MMAⅢ和DMAⅢ诱导Caspase3和PARP活化呈时间依赖性和剂量依赖性变化。iAsⅢ则无明显的Caspase3和PARP活化。接下来探讨了其代谢产物诱导凋亡的相关通路。我们发现,MMAⅢ及DMAⅢ处理细胞后,细胞线粒体抗凋亡蛋白Bcl-2显著下调,而促凋亡蛋白Bax从细胞浆转移至线粒体,诱导大量Cytochrome C释放。但iAsⅢ处理后,没有观察到显著性变化。值得注意的是,.在分离纯化的大鼠肝脏线粒体实验中,加入3种砷化合物处理30min后,发现iAsⅢ对诱导线粒体Cytochrome C释放无明显作用(即使最高浓度为100μM),二甲基DMAⅢ在高剂量组下可诱导Cytochrome C释放(50-100μM)。与此不同的是,单甲基MMAⅢ在低剂量可诱导Cytochrome C释放(1μM)。这提示我们,虽然MMAⅢ和DMAⅢ都有很强的诱导细胞凋亡作用,但其诱导凋亡机理不相同。为了阐明DMAⅢ诱导细胞凋亡机理,我们探讨了内质网应激相关蛋白的表达情况。结果显示,DMAⅢ具有很强的诱导内质网应激作用,DMAⅢ可诱导PERK、 eif2α、ASK1、JNK的磷酸化及CHOP上调,而iAsⅢ和MMAⅢ处理细胞后则无内质网应激相关通路激活。结论：以上结果提示,无机砷及其代谢产物对NB4细胞作用不同。iAsⅢ主要起诱导NB4细胞分化成熟的作用,提高iAsⅢ作用浓度及时间亦可引起细胞凋亡。而MMAⅢ及DMAⅢ无诱导分化作用,主要以诱导细胞凋亡为主。同时2个代谢产物引起NB4细胞凋亡的机制不同,MMAⅢ直接作用于线粒体,通过对线粒体的毒性引起细胞凋亡。DMAⅢ则通过内质网应激通路引起线粒体毒性或直接引起细胞凋亡。