论文摘要
中药复方四物汤是中医补血活血的经典良方，由于其具有补血养肝和活血调经的显著功效，临床上常用于血虚、血滞之证和妇科疾病的治疗。四物汤由熟地黄、当归、白芍和川芎四味药材组成，分别为四物汤的“君臣佐使”药。研究表明四物汤中果糖（熟地黄）、阿魏酸（当归和川芎）、芍药苷（白芍）和川芎嗪（川芎）4个成分在受60Co辐射致贫血的小鼠体内具有生血的作用；同时，当4个成分同时配伍给药后，芍药苷和阿魏酸两个单体引起的体重减轻作用消失，而这种作用可能是一种不良的反应。本课题的研究目的是通过四物汤有效成分代表性组分在大鼠体内的药代动力学相互研究，探讨其与中医“君臣佐使”理论的相关性，为四物汤有效成分组方制剂的研究与开发提供具有重要指导意义的数据信息。根据文献数据挖掘和前期的研究，从熟地黄、当归、白芍和川芎中分别选出1～3个有效成分，通过测定有效成分在药材中的含量以及考察四物汤和四物合剂在体内活性成分吸收入血的情况，从而确定了熟地黄、当归、白芍和川芎的有效成分中各自具有代表性的组分。最终，通过代表性组分的组合配伍，研究代表性组分在大鼠体内的药代动力学相互作用。第一部分HPLC法测定四物汤配伍药材提取液中9个有效成分的含量经前期的研究和文献数据的挖掘，从四味药材中分别选择以下9个有效成分作为研究对象，即：5-羟甲基糠醛、梓醇和毛蕊花糖苷(熟地黄)；丁苯酞、藁本内酯和阿魏酸（当归）；芍药苷和芍药内酯苷（白芍）；丁苯酞、藁本内酯和阿魏酸川芎嗪（川芎）。建立9个有效成分的高效液相色谱分离方法，分别对四味药材的提取液中对应各有效成分的含量进行分析。熟地黄和川芎嗪采用50%甲醇水进行超声提取，当归和白芍分别采用70%甲醇水和50%乙醇水进行超声提取。以乙腈：水（0.5%H3PO4）为流动相，色谱柱Agilent HC-C18（4.6×250mm；5μm）进行分离，对提取液进行HPLC分析。结果表明，5-羟甲基糠醛和毛蕊花糖苷在熟地黄中的含量约为0.14%和0.07%；丁苯酞、藁本内酯和阿魏酸在当归中的含量约分别为0.01%、2.05%和0.04%，芍药苷和芍药内酯苷在白芍中的含量约分别为2.27%和0.41%；5-羟甲基糠醛、川芎嗪和阿魏酸在川芎中的含量约分别为0.02%、0.02%和0.06%。综上所述，9个有效成分在药材中的含量差异较大，其中藁本内酯、芍药苷和芍药内酯苷的含量较高，可作为重点关注的有效成分。第二部分四物汤和四物合剂在大鼠体内的入血有效成分及其药动学性质建立该9个有效成分的液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）的分离检测方法，研究口服给药后，四物汤和四物合剂在大鼠体内吸收入血的有效成分及其药代动力学性质。分别将四物汤和四物合剂临床用水煎液进行冻干，并用LC-MS/MS测定了各有效成分的含量。Wistar大鼠随机成四物汤组和四物合剂组，于给药前、给药后不同时间点采集血样。大鼠血浆样品用乙腈进行蛋白沉淀处理，用LC-MS/MS检测血浆样品中的各有效成分含量。血药浓度-时间数据由WinNonlin5.2统计软件进行药代参数的计算，统计学分析由SAS9.2软件进行处理。经LC-MS/MS方法测定，在两个方剂冻干后的水复溶液中都检测到了梓醇、藁本内酯、丁苯酞、芍药苷和芍药内酯苷，其在四物汤和四物合剂中的浓度分别为2.94、244.67、4.24、1411.65、261.83mg L-1和3.64、255.50、4.68、1456.65、297.00mg L-1。毛蕊花糖苷、阿魏酸和川芎嗪两个方剂中的含量都低于其检测限。灌胃给药四物汤和四物合剂后，在大鼠血浆中可以检测到少量梓醇，但无法准确定量；含量偏高且能够准确定量的成分是芍药苷和芍药内酯苷。四物汤组与四物合剂组中芍药苷和芍药内酯苷在大鼠体内吸收和消除均较快。二者的主要药动学参数（T1/2，Tmax，Cmax和AUC等）在四物汤组和四物合剂组之间的无显著差异。综上所述，梓醇、芍药苷和芍药内酯苷均可作为四物汤有效成分代表性组分；药材配伍比例的变化对芍药苷和芍药内酯苷的药动学性质无显著影响。第三部分测定生物样品中梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪含量的LC-MS/MS方法建立和确证依上述结果，梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪可作为四物汤有效成分的代表性组分。本部分的目的是建立测定大鼠血浆中梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪的LC-MS/MS方法，为研究临床血虚患者口服中药复方四物汤和四物合剂后梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪在人血清的含量，以及研究梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪等5个有效成分组合配伍给药前后在大鼠体内的药代动力学相互作用提供检测分析手段。梓醇以甲醇和水（含5mM甲酸铵）作为流动相，色谱柱为Diamonsil C18(2.1×150mm；5μm)进行分离，采用MRM（多反应监测）和正离子模式的检测方式，内标为桃叶珊瑚苷。藁本内酯和川芎嗪以甲醇:0.1%甲酸（78:28）作为流动相恒梯度洗脱，色谱柱为Thermo Syncronis C18(2.1×150mm；3.7μm)进行分离，采用MRM（多反应监测）和正离子模式的检测方式，内标为地西泮。芍药苷和阿魏酸以乙腈和水（0.1%甲酸）作为流动相，色谱柱为Thermo Syncronis C18(2.1×150mm；3.7μm)进行分离，采用MRM（多反应监测）和负离子模式的检测方式，内标为葛根素。血浆样品前处理采用乙腈沉淀蛋白，对测定大鼠血浆中梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪的LC-MS/MS方法进行全确证，内容包括方法的专属性、方法的精密度和准确度、稀释效应、基质效应、回收率和稳定性。结果表明，大鼠血浆中的内源性物质不干扰梓醇等有效成分的测定；批内和批间精密度和准确度均在±15%以内，精密度和准确度良好，符合生物样品分析的要求；梓醇和藁本内酯的标准血浆样品稀释5倍（5000→1000；500→100）后，精密度和准确度均在±15%以内，表明无明显稀释效应；梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪的基质效应均在85.73%～107.19%的范围内，回收率则在90.93%～108.63%的范围内，表明方法无明显的基质效应，回收率符合生物样品分析的要求；大鼠血浆中的梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪分别进行室温放置4h、样品处理后4℃进样器放置24h、反复冻（-20℃）融（室温）3次和长期冻存后，所测得的RSD%和RE%值均在±15%以内，表明梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪在上述条件下稳定性良好。综上所述，实验建立了可同时检测大鼠血浆中藁本内酯和川芎嗪、可同时检测大鼠血浆中芍药苷和阿魏酸以及大鼠血浆中梓醇的3个LC-MS/MS方法，该3个方法专属性强、灵敏度高和重复性好，适用于梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪的体内研究。第四部分临床受试者口服四物汤和四物合剂后血清中代表性有效成分的分析利用所建立的测定生物样品中梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪的LC-MS/MS方法，测定该5个有效成分在临床受试者口服四物汤和四物合剂后所采集的血清中的含量，为四物汤有效成分代表性组分的选择提供重要依据。35位临床血虚患者随机分为四物汤组（n=17）和四物合剂组（n=18），按照临床用药剂量早晚各服用一包四物汤或者四物合剂，连续服用22天。于服药前及连续服药的第22天清晨服药后1h和2h采集血清样品。血清样品前处理采用1.5倍体积的乙腈沉淀蛋白，随后用LC-MS/MS进行分析。结果表明，临床血虚证患者服用中药复方四物汤或四物合剂后，在其血清中均检测到了芍药苷和藁本内酯，两者含量分别在2.12～18.44和2.18～7.20ng·mL-1的范围内，而梓醇、阿魏酸和川芎嗪则低于检测限。因此，芍药苷和藁本内酯可作为四物汤有效成分代表性的组分。同时，藁本内酯和芍药苷在四物汤组中可检测到的病例数要明显多于四物合剂组，推测四物汤更利于有效成分在体内的吸收。这些有效成分在体内吸收差异是否体现了四物汤和四物合剂的疗效优劣，对于这个问题，本课题组欲通过高分辨质谱的技术和代谢组学的方法进行研究，目前这部分实验正在进行中。第五部分四物汤5个有效成分代表性组分组合配伍后在大鼠体内的相互作用通过将四物汤有效成分代表性组分梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪进行组合配伍，考察其在大鼠体内的药代动力学相互作用。将Wistar大鼠随机分组为梓醇组、藁本内酯组、阿魏酸组、芍药苷组、川芎嗪组、（梓醇+藁本内酯+阿魏酸）组、（梓醇+芍药苷）组、（梓醇+川芎嗪）组、（梓醇+藁本内酯+阿魏酸+芍药苷）组、（梓醇+藁本内酯+阿魏酸+川芎嗪）组、（梓醇+芍药苷+川芎嗪）组和（梓醇+藁本内酯+阿魏酸+芍药苷+川芎嗪）组，给药剂量分别为3.5mg·kg-1（梓醇）、100mg·kg-1（藁本内酯）、3mg·kg-1（阿魏酸）、100mg·kg-1（芍药苷）和1mg·kg-1（川芎嗪）。采用灌胃给药的方式，于给药前、给药后不同时间点采集大鼠血样。用LC-MS/MS检测血浆样品中的有效成分代表性组分的含量。血药浓度-时间数据由WinNonlin5.2统计软件进行药代动力学参数的计算。药代动力学参数的差异由SAS9.2软件采用单因素方差分析的方法进行统计分析。对于梓醇，与单独给药比较，配伍混合给药后梓醇的Cmax和AUC明显减小（P<0.05）。当梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪同时混合给药时，梓醇的在大鼠体内的平均滞留时间MRT明显长于（梓醇+藁本内酯+阿魏酸+川芎嗪）组和（梓醇+芍药苷+川芎嗪）组中梓醇的MRT （P<0.05）。梓醇与其它4个有效成分混合给药前后，梓醇的生物半衰期T1/2和达峰时间Tmax基本保持不变。对于藁本内酯，（梓醇+藁本内酯+阿魏酸）组中藁本内酯的T1/2和Tmax明显短于藁本内酯单独给药组以及含藁本内酯的混合给药组。而当梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪同时混合给药时，藁本内酯的AUC明显大于藁本内酯单独给药组（P<0.05）。混合给药后，藁本内酯的平均滞留时间MRT略短于藁本内酯单独给药组（P<0.05）。藁本内酯与其它4个有效成分混合给药前后，藁本内酯的达峰浓度Cmax无明显变化。对于阿魏酸，混合配伍给药后，阿魏酸的Cmax与阿魏酸单独给药时相比明显减小（P<0.05）。除了（梓醇+藁本内酯+阿魏酸）组之外，其它3个配伍给药组中阿魏酸的AUC明显小于阿魏酸单独给药组（P<0.05）。同时，当梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪同时配伍给药时，阿魏酸的达峰时间Tmax相比阿魏酸单独给药组略显延长（P<0.05），其它配伍给药组则无显著变化。芍药苷与其它4个有效成分配伍给药前后，对芍药苷的主要药动学参数T1/2、Tmax、Cmax和AUC无显著影响。但当梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪同时配伍给药时，芍药苷在大鼠体内的平均滞留时间MRT明显长于（梓醇+藁本内酯+阿魏酸+芍药苷）组中芍药苷的MRT（P<0.05）。对于川芎嗪，与川芎嗪单独给药相比较，川芎嗪与其它4个有效成分组合配伍给药后川芎嗪的Cmax和AUC均明显增大（P<0.05）。（梓醇+藁本内酯+阿魏酸+芍药苷+川芎嗪）组与（梓醇+川芎嗪）组和（梓醇+芍药苷+川芎嗪）组相比较，川芎嗪的Cmax和AUC均明显增大（P<0.05）。同时，（梓醇+藁本内酯+阿魏酸+川芎嗪）组与（梓醇+芍药苷+川芎嗪）组相比较，川芎嗪的AUC明显增大（P<0.05）。综上所述，分别来自四物汤的四味配伍药材的5个有效成分代表性组分在大鼠体内存在复杂的药代动力学相互作用，其潜在的作用机制尚不完全明确，需待进一步的研究。本研究为四物汤有效成分组方制剂的研究提供了有价值的信息，对四物汤有效成分组方制剂的研究具有重要的指导意义。