论文摘要
目的：本研究是从壁虎醇提物（Gecko ethanol extract，GEE）中提取出壁虎多肽混合物（Gecko peptides mixture, GPM），并在体外对壁虎多肽混合物抑制肿瘤细胞生长及其机制进行初步探究。方法：将壁虎醇提物用蒸馏水配置成浓度为50mg/mL的溶液，经G-25葡聚糖凝胶柱层析后回收各峰溶液，冷冻干燥后对其进行活性筛选，具有抗肿瘤活性的成分即为壁虎多肽混合物；用Bradford法检测壁虎多肽混合物的蛋白含量。体外培养食管癌EC109和肝癌HepG2细胞，采用MTT法检测壁虎多肽混合物对EC109和HepG2细胞增殖的抑制作用；倒置显微镜下观察壁虎多肽混合物(0-0.3mg/mL)作用EC109和HepG2细胞24h后形态的变化；Hoechst33258荧光染色法观察壁虎多肽混合物作用24h后EC109和HepG2细胞的凋亡变化；免疫组化法观察壁虎多肽混合物作用EC109细胞24h后caspase-3及Bcl-2的蛋白表达情况；caspase活性测试检测壁虎多肽混合物作用HepG2细胞24h后caspase-3与caspase-9蛋白活性的变化；Western blot检测壁虎多肽混合物作用于HepG2细胞24h后caspase-3，caspase-9，AIF与Cyt c蛋白表达的变化。结果：经G-25葡聚糖凝胶柱层析后，可将壁虎醇提物分为4个峰，活性检测后发现峰A具有显著的抗肿瘤活性，即为壁虎多肽混合物；Bradford法检测壁虎多肽混合物的蛋白含量为43.9%。壁虎多肽混合物在体外对EC109和HepG2细胞的增殖有显著的抑制作用，随着时间的增加与剂量的增大，抑制作用更明显。0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.3mg/mL壁虎多肽混合物处理这两种肿瘤细胞24h、48h、72h后，EC109细胞半数抑瘤率IC50分别为0.317mg/mL、0.227mg/mL、0.183mg/mL，HepG2细胞半数抑瘤率IC50分别0.154mg/mL、0.133mg/mL、0.051mg/mL。壁虎多肽混合物作用这两种细胞24h后，倒置显微镜下观察可见，与阴性对照组相比，给药组细胞数目减少，变圆、皱缩，体积减小，且随着剂量的增加，脱壁的细胞增多。壁虎多肽混合物作用EC109，HepG2细胞24h后，Hoechst33258荧光染色结果显示给药组出现染色质固缩、致密、荧光增强等明显的凋亡形态，且与低剂量组相比，高剂量组细胞凋亡更加明显。壁虎多肽混合物作用EC109细胞24h后，免疫组化结果显示经药物处理后，凋亡蛋白Bcl-2表达降低、caspase-3表达增高，与阴性对照组相比，差异均具有统计学意义（P<0.01）。壁虎多肽混合物作用HepG2细胞24h后，凋亡蛋白caspase-3，caspase-9活性增强，呈现浓度依赖性；AIF和Cyt c从线粒体中释放到胞浆中，蛋白表达增加，caspase-3，caspase-9蛋白表达升高。结论：壁虎多肽混合物在体外可抑制肿瘤细胞的增殖，并诱导其凋亡，其机制可能与激活线粒体途径有关。