论文摘要
第一章马兜铃酸Ⅰ致比格犬肝损伤与MAPEG介导的炎症介质相关性研究目的：明确马兜铃酸Ⅰ(aristolochic acid I, AAI)经口给予比格犬是否具有肝损伤作用,并探索肝损伤过程是否有花生四烯酸和谷胱甘肽代谢膜关联蛋白(membrane associated proteins in eicosanoid and glutathione metabolism, MAPEG)介导的炎症介质半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes, cysLTs)及前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)生成,为进一步阐明AAI致肝组织炎症损伤机制提供依据。方法：健康成年比格犬8只,每组4只。实验组口服3mg/kg/day AAI胶囊,对照组口服空胶囊；连续给药至第10天,并于第12天处死。分别在给药后第0、1、5、9、11天采集血样,分析肝功能损伤情况。采用苏木素-伊红染色法对肝组织进行病理学检查。采用ELISA法检测肝组织半胱氨酰白三烯含量变化情况；Western blot法和免疫组织化学法评价肝组织微粒体谷胱甘肽S-转移酶2(microsomal glutathione transferase2, mGST2), mGST3,白三烯C4合酶(leukotriene C4synthase, LTC4S),5-脂氧酶激活蛋白(5-lipoxygenase activatingprotein, FLAP),微粒体前列腺素E合酶1(microsomal prostaglandin E synthase, mPEGS-1)等MAPEG的表达和分布情况。结果：AAI连续给药10天,可引起比格犬血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平显著升高。组织切片显微镜下观察,肝组织肝窦内呈现淤血、中央静脉周围出现大量炎细胞浸润、肝小叶条索状结构破坏；提示AAI对比格犬肝组织可能具有炎性损伤作用。AAI致肝组织cysLTs生成量显著上调,伴FLAP和mGST2表达增加,mGST3和LTC4S表达无显著性变化。鉴于FLAP主要表达于肝窦枯否细胞中,mGST2表达于肝实质细胞胞浆内,推测AAI可能通过上调枯否细胞FLAP和肝实质细胞mGST2表达,诱导炎症介质cysLTs生成,引起肝组织炎症损伤。肝组织mPGES-1,总蛋白水平虽有显著降低,但在肝小叶中央静脉周边区表达明显增加；提示AAI可能通过诱导mPGES-1局部增加,特异性损伤中央静脉周围组织。结论：比格犬连续10天经口给予3mg/kg/day AAI,可通过(1)上调FLAP和mGST2表达并介导cysLTs生成增加,(2)mPGES-1在肝小叶中央静脉周边区表达增加,致肝组织炎症损伤。第二章马兜铃酸Ⅰ致比格犬肝损伤分子机制研究目的：探索AAI致比格犬肝组织炎症损伤时,cysLTs相关炎症信号转导通路白介素-6(interleukin-6, IL-6)和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)关联机制是否介导AAI致肝损伤的分子机制。方法：健康成年比格犬8只,每组4只；实验组经口给予3mg/kg/day AAI胶囊,对照组口服空胶囊；连续给药至第10天,并于第12天处死。Western blot法考查AAI对细胞核内核转录因子-κB (nuclear factor-κB, NF-κB)和细胞质中磷酸化κκB抑制因子(inhibitor of κB,IκB)表达影响情况。ELISA法检测肝组织炎性细胞因子IL-6变化情况,并用Western blot法和免疫组织化学法评价肝组织白介素-6受体a(interleukin-6receptor α, IL-6Rα)和EGFR表达与活化情况。Western blot法检测细胞丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)家族p38、胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、c-Jun氮末端蛋白激酶(c-jun N-terminal kinase, JNK)及其磷酸化水平；促凋亡蛋白Bax、抑凋亡蛋白Bcl-2、凋亡终端蛋白caspase3、细胞色素C等线粒体依赖凋亡通路。结果：AAI连续给药10天,可引起比格犬肝细胞核NF-κB表达增加,胞浆P-IκB水平显著上调,提示NF-κB可能参与AAI致肝组织炎症损伤过程。肝组织IL-6含量和IL-6Rα表达均显著增加,IL-6Rα主要表达于肝实质细胞膜上,而p-EGFR表达显著下降,提示AAI致肝损伤可能选择性启动IL-6相关信号通路。ERK和JNK磷酸化激活,而p38未见明显磷酸化；推测AAI可能通过ERK磷酸化诱导炎症介质cysLTs水平上调,而JNK可能促进Bax向线粒体膜的转移过程,激活凋亡通路。线粒体依赖凋亡通路中促凋亡蛋白Bax增加,抑凋亡蛋白Bcl-2无明显变化,Bax/Bcl-2比值上调,线粒体膜通透性改变,细胞色素C从线粒体释放进入胞浆,最终导致凋亡终端蛋白caspase3裂解片段cleaved caspase3显著增加；提示JNK激活的线粒体依赖凋亡通路参与AAI致比格犬肝损伤过程。结论：AAI经口给予比格犬所致肝损伤可能通过(1)炎症介质cysLTs激活NF-κB的核转移过程,并选择性地增加炎症因子IL-6分泌；(2)JNK激活Bax引起的线粒体依赖凋亡通路；介导肝组织炎症损伤。同时,AAI可通过激活ERK诱导炎症介质cysLTs水平上调。