论文摘要
细菌总数是食品质量控制的重要指标，对食品及其加工环境的监测有重要的意义，在食品卫生安全以及疾病防控中扮演着重要的角色。准确、快速、灵敏的细菌总数检测技术的研究与开发是食品安全检测研究的热点方向。细菌荧光素酶生物发光体系是基于细菌胞内NADH含量恒定且细菌数量与NADH含量有很好的相关性而建立的，通过对NADH的定量检测可达到检测细菌数量的目的。本实验室已将该方法应用于大肠杆菌、克雷伯氏菌、副溶血弧菌的检测，但是由于胞内NADH的低水平含量，检测限局限于107cfu/mL左右，不能满足许多高灵敏检测的要求，因而补充适宜的发光底物，最大限度地提高检测灵敏度是亟需解决的问题。本论文根据细菌荧光素酶生物发光体系的发光强度与其必需底物NAD(P)H的良好相关性，借助外源酶促反应将氧化型吡啶核苷酸转化为还原型吡啶核苷酸，提高生物发光方法检测灵敏度，达到定量检测细菌数量的目的；此外胞内低水平的ATP通过扩增反应实现对数增长并转化为NADH，借助细菌生物发光方法达到定性检测细菌数量的目的。第一：根据酶促反应可实现吡啶核苷酸之间相互转化的原理，通过对酶促反应条件优化，建立了乙醇脱氢酶体系、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶体系、乳酸脱氢酶体系、谷胱甘肽还原酶体系。四种体系可以实现NAD+与NADH、NADP+与NADPH之间最大程度转化，为酶促细菌生物发光法应用于细菌总数的检测奠定基础。第二：应用细菌生物发光反应与NAD(P)+还原反应结合定量检测细菌总数。根据胞内氧化型吡啶核苷酸（NAD+、NADP+）可以分别通过乙醇脱氢酶体系、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶体系转化成还原型吡啶核苷酸（NADH、NADPH），从而实现信号的放大，达到提高灵敏度的目的。以四种吡啶核苷酸含量为媒介，细菌生物发光强度与细菌总数呈良好的线性关系（R2=0.98），检测限可达到1.05×105cfu/mL，与之前发光体系相比灵敏度提高100倍。第三：应用细菌生物发光反应与ATP扩增反应结合定性检测细菌总数。胞内低浓度的ATP借助扩增反应可实现ATP的对数增长，将生成的ATP利用NAD合成酶、乙醇脱氢酶转化为可被细菌荧光素酶生物发光系统检测的NADH。以胞内ATP为媒介，进行大肠杆菌ATP扩增实验，120min内可定性检测101cfu/mL的大肠杆菌，极大地提高了细菌生物发光方法检测的灵敏度。