论文摘要
以DHA和EPA为代表的n-3多不饱和脂肪酸在人体的营养、发育和健康等方面起着重要作用。DHA和EPA食用的最好形式为甘油三酯,但是天然甘油三酯型鱼油中DHA和EPA含量较低,本文利用生物酶法催化酯交换反应制备含DHA和EPA含量在45%的甘油三酯,主要研究内容如下：1测定了包括脂肪酶J、U、P、T、B、L、M、N、Lipozyme TL IM和Lipozyme RMIM在内的10种脂肪酶的含水量和水解酶活,并建立了在无溶剂体系中测定脂肪酶酯交换酶活的方法,在此基础上比较了各脂肪酶的酯交换酶活。在10种脂肪酶中,来自褶皱假丝酵母(Candida Rugosa)的脂肪酶M水解酶活最高(为4702.7 U/g),其次为脂肪酶L, Lipozyme TL IM和Lipozyme RM IM的水解酶活分别为356.7 U/g和407.2 U/g。酯交换酶活的测定以正辛酸乙酯和三油酸甘油酯为底物,反应条件为：正辛酸乙酯和三油酸甘油酯的质量比为1：1,脂肪酶添加量为1%(占底物总质量),反应温度为60℃,反应时间为2h。利用该方法测得脂肪酶M的酯交换酶活最高,大约是常用于催化酯交换反应的Lipozyme RM IM的两倍。因此选用脂肪酶M作为酯交换反应的催化剂,制备含45%DHA和EPA的甘油三酯。通过对脂肪酶水解活力和酯交换活力的比较,发现脂肪酶的水解活力与酯交换活力之间的相关性不高。2建立了一种正相高效液相色谱-蒸发光散射检测器联用的方法,用于测定鱼油中甘油酯组成。色谱柱为Rx-SIL型正相硅胶色谱分析柱(250mm×4.6mm i.d.,5μm),柱温为35℃；流动相为正己烷-异丙醇-乙酸(90：10：0.2,V/V),流速为0.8mL/min;蒸发光散射检测器漂移管温度60℃,载气流速1.4 L/min,可在12min内完成一个样品的测定。标准品的色谱峰与进样质量成线性关系,峰面积变异系数小于1.5%,最低检出限为0.02-0.05μg,加标回收率为98.25%-103.08%。该方法可以较为快速准确地测定甘油酯混合物中甘油三酯、甘油二酯和单甘油酯的含量,而不受脂肪酸组成的影响。3利用筛选出的脂肪酶M催化酯交换反应,在无溶剂体系中制备DHA和EPA含量达45%的甘油三酯。首先比较了酯交换反应中酸解和酯-酯交换反应的优缺点,在相同的反应条件下,酸解反应的速度略快于酯-酯交换反应。综合考虑酸解反应和酯-酯交换反应工艺过程的优缺点,选择酯-酯交换法用于制备EPA和DHA总含量在45%的甘油三酯。利用鱼油乙酯和甘油三酯(EPA和DHA含量为28.87%)作为底物,考察了温度(40℃-70℃)、反应时间(6-60h)、加酶量(40-200U)、底物质量比(2：1-1：3)、加水量(0.5%-8%)以及乙酯鱼油中EPA和DHA的含量对酯交换反应的影响,通过正交试验发现,在选定的因素水平范围内,反应时间对酯交换结果的影响最大,其次是加酶量,对酯交换反应影响最小的是底物质量比,得到的较优的工艺条件为：反应温度60℃,反应时间24h,底物质量比为5：4,加酶量为80U,不向反应体系中加入水分。在该条件下酶反应得到的甘油三酯中EPA和DHA的含量分别为32.40%和13.10%,在该条件下脂肪酶重复利用7次仍能达到工艺目标。通过对底物与产物中EPA和DHA的含量的变化可推断出在无溶剂体系中,脂肪酶M对EPA的选择性大于DHA。