论文摘要
背景与目的中枢或外周神经系统损伤或功能障碍会引起以自发痛、痛觉过敏和痛觉超敏为特征的神经病理性疼痛,其发生机制复杂,不易治疗。研究发现,SCN9A的单核苷酸突变与先天性痛觉异常疾病密切相关。SCN9A基因错义突变会导致原发性红斑肢痛症(Primary erythermalgia,PE)和阵发性剧痛症(paroxysmal extreme pain disorder PEPD),而SCN9A基因单碱基缺失则导致先天性无痛症(congenital inability to experience pain CIP)。由此推测,SCN9A可能是疼痛发生和发展过程中的一个关键因素。SCN9A基因位于2号染色体,全长6000bp,有26个外显子,编码河豚毒素(TTX)敏感的电压门控钠离子通道Navl.7的a亚基,主要表达在外周背根神经节和交感神经节神经元中。MicroRNA (miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,主要参与转录后基因的表达调控。当miRNA与靶mRNA完全结合时,靶mRNA直接被降解；不完全结合时,则阻遏其翻译蛋白。我们利用生物信息学软件Targetscan进行预测,miR-30b与SCN9A相关性最强,由此我们提出假说：正常生理状态下,miR-30b能够控制SCN9A由mRNA向蛋白Navl.7的翻译,使Navl.7保持稳态。当外周神经损伤,miR-30b表达下调,减少了对SCN9A mRNA的抑制,使Navl.7表达增加,从而导致神经元兴奋性增强,最终引起病理性疼痛。因此,本实验利用坐骨神经分支选择性损伤(the sciatic nerve injury,SNI)制作大鼠神经病理性疼痛模型,通过过表达和抑制miR-30b的表达,检测SCN9A mRNA水平和蛋白水平的变化,同时检测大鼠痛阈变化验证所提假说,为神经病理性疼痛的发病机制提供理论依据,为其治疗提供新靶点。方法(1)坐骨神经分支选择性损伤模型(SNI)分别双重结扎大鼠胫神经、腓总神经,在双重结扎的中央切断,并分别去除断端2-4mm的神经干。(2)50%缩足阈值的测定(von Frey test)大鼠在刺激时间内出现快速的缩足反应,记为阳性反应,应用Dixon (1980)报道的方法推算出50%缩足阈值。当50%缩足阈值小于4g时认为出现痛敏。(3) qRT-PCR荧光实时定量PCR为目前检测miRNA最常用和最主要的方法,其具有快速、特异性强、灵敏度高等优点。(4)免疫组化荧光双标用于对Navl.7进行定位和半定量的检测,能直观有效的展示实验结果。(5) Western blot用于检测Navl.7蛋白表达量的变化。(6)双荧光素酶报告基因分析法荧光素和荧光素酶这一生物发光体系,可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。(7)鞘内置管用5号注射器针头刺入椎管钻孔,然后用镊子夹住导管尖端轻柔地将导管向上置入,此时导管内可见清亮的脑脊液流出。出现甩尾或抖动反射表明穿刺成功。导管置入深度约为1.5-2.0cm。结果1.神经病理性疼痛中,miR-30b表达减少,反之,SCN9A的表达增加。2. miR-30b抑制SCN9A翻译为Navl.7。3.鞘内注射miR-30b类似物能缓解大鼠神经病理性疼痛。结论体内和体外实验证实,miR-30b参与调节SCN9A的表达；在神经病理性疼痛过程中miR-30b抑制SCN9A翻译为Navl.7蛋白,从而缓解神经病理性疼痛。