论文摘要
焦炉逸散物中的致癌性多环芳烃是导致焦炉工肺癌的主要原因,已被国际癌症研究署定义为“Ⅰ类致癌物”,即“明确的人类致癌物。已往研究发现焦炉逸散物(Coke oven emissions, COE)致肺癌过程中发生较多的遗传改变,而表观遗传学改变如DNA甲基化修饰等是否参与该过程,尚缺乏足够的认识。本研究首先探讨了83名焦炉作业工人和62名非暴露工人外周血淋巴细胞O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT)启动子区甲基化水平与遗传损伤指标及MGMT启动子区基因多态性的关系。采用焦炉逸散物有机提取物诱导正常人肺上皮细胞,构建体外细胞恶性转化模型,通过比较恶性转化细胞克隆株中及不同转化阶段细胞中遗传指标和MGMT基因甲基化的改变,探讨COE暴露致癌早期的生物标志物及细胞在恶性转化过程中的遗传损伤和表观遗传损伤机制,研究结果如下：1、焦炉逸散物暴露人群MGMT启动子区甲基化改变的研究对83名多环芳烃暴露工人和62名非暴露工人外周血淋巴细胞MGMT基因甲基化水平与MGMT基因启动子区基因多态性关系的分析显示,COE暴露人群呈低甲基化改变,发现COE暴露组和非暴露组中MGMT启动子区的CpG位点存在差异,且MGMT甲基化水平与暴露水平相关；校正了性别、年龄、吸烟和自然对数转换尿1-OHP后,在COE暴露组和和非暴露组中均未发现MGMT启动子区甲基化率与MGMT基因rsl625649基因多态性相关。2、焦炉逸散物有机提取物诱导人支气管上皮细胞恶性转化模型的构建及鉴定2.1焦炉逸散物的采集、浓度的测定及肺癌风险率的评估：采用定点采样法采集炉顶上升管处焦炉逸散物,气相色谱-质谱法检测OE-COE的主要成分,根据相对效力因子(Relative potency factor, RPF)换算出COE的BaP等效质量浓度(Benzo[a]pyrene equivalent concentration, BaPeq)为53.41ug/m3,结合BaP单位风险系数(Unit risk of exposure to BaP,URBAP)计算出吸入COE的肺癌风险率为4.47。2.2细胞恶性转化模型的构建：按5×104个/ml的密度接种细胞,24h后用低剂量BaP诱导CYP1A1/1A2的表达(48h),采用5、10、20、40μg/ml剂量焦炉逸散物有机提取物(Organic extracts of coke oven emission, OE-COE)诱导细胞恶性转化,24h后撤去诱导液,继续培养24h后,收获细胞,进行第二次染毒,按照第一次的方法进行细胞接种-诱导酶表达-诱导细胞恶性转化-培养-收获细胞；选用BaP (20μmol/L)为阳性对照,1%oDMSO作为阴性对照。2.3细胞恶性转化模型的鉴定：对具有恶性转化特征的细胞进行如下鉴定：裸鼠皮下接种细胞克隆株20天后,可见明显的肿瘤组织形成,肿瘤组织病理分析结果和肿瘤组织和细胞免疫组化分析结果均显示为低分化鳞癌。染色体畸变结果显示细胞系染色体数目稳定,变异较稳定,多为缺失和移位。仅在RF细胞克隆株中检出P53第9外显子73(G>C)发生杂合点突变,在其他细胞克隆株中未检出突变。细胞周期检测结果显示,各细胞克隆株的G1期明显缩短,S期和G2期明显延长；细胞生长曲线结果显示恶性转化细胞克隆失去了生长接触抑制效应,出现恶性增生,细胞平均倍增时间明显缩短为28.72h。上述各鉴定指标均显示细胞已具有一般恶性转化细胞的表现特征,可以作为恶性转化相关性研究的一个较为适宜的细胞模型。3、焦炉逸散物有机提取物诱导细胞恶性转化过程中遗传损伤和DNA甲基化改变根据第一部分细胞鉴定的结果分别选取OE-COE诱导50d、100d和120d细胞株及对应的溶剂对照组细胞和未经任何处理的HBE细胞作为本底对照,挑选10个经裸鼠皮下注射成瘤的细胞克隆作为恶性转化细胞株(RB、RC、RE、RF、RG、RJ、RK、 RI、RN、RO);选取BaP诱导75d、150d和255d及对应的溶剂对照组细胞,挑选4个经裸鼠皮下注射成瘤的细胞克隆作为恶性转化细胞株(RA、RE、RO、RQ);分别观察上述细胞的遗传损伤指标及MGMT启动子区甲基化改变。同时采用2.5、5、10、20μg/ml的细胞连续染毒细胞5天,观察短时间染毒细胞模型中各遗传损伤指标和MGMT启动子区甲基化改变。遗传损伤指标结果显示：在短时间染毒模型和恶性转化模型中,胞质阻滞细胞组学指标和彗星OliveTM和BPDE-DNA加合物均随染毒剂量的增加和诱导时间的延长呈上升趋势,相对端粒长度表现为明显的降低趋势,其中端粒相对长度和核芽率变化比较明显。MGMT基因表达及甲基化检测结果显示：在急性染毒模型和恶性转化模型中,MGMT启动子区甲基化均表现为低甲基化改变,仅在RC和RF细胞克隆株中观察到高甲基化改变,提示细胞克隆可能存在异质性。总之,在焦炉作业工人中发现MGMT基因呈低甲基化改变；MGMT基因启动子区低甲基化改变和端粒相对长度及核芽率可能是发生在COE诱导细胞恶性转化过程中早期的分子生物学事件。OE-COE中含有大量的多环芳烃,有较强的致癌性,20mg/mlOE-COE诱导细胞120d可诱发细胞发生恶性转化,但恶性转化细胞在遗传物质损失水平和DNA甲基化水平上存在差异,表明化学致癌物诱发的恶性转化细胞克隆具有异质性,提示采取挑选细胞克隆的方法是可取的。