论文摘要
白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病，其生物学特征为造血细胞增殖失控、分化成熟受阻、正常凋亡过程发生障碍以致异常分化的细胞大量增殖。据报道，我国白血病的发病率在各种肿瘤中占第六位。目前，白血病的治疗方法有多种，如放射疗法、化学药物治疗、靶向治疗、免疫治疗、干细胞移植等，但这些疗法有的副作用大，易产生耐药性，有的费用昂贵。因此，急需要寻找一种高效的抗白血病的药物。中药及其有效成分因其高效低毒的抗肿瘤活性而被大家所关注，人参皂苷单体Rh2[20(S)-ginsenoside Rh2, Rh2(S)]是人参的有效成分之一，对卵巢癌、胃癌、肝癌和白血病等多种肿瘤细胞具有增殖抑制、诱导分化和促进凋亡的作用[1-4]。有研究报道显示，组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase, HDAC）的激活及其异常表达与癌症的发生发展有关[5]。近年来，以组蛋白去乙酰化酶为癌症治疗的潜在靶点吸引了越来越多科研人员的注意，去乙酰化酶抑制剂作为一种新型高效低毒的抗肿瘤药物而得以研发，且其分子作用机制与Rh2(S)类似，主要是抑制增殖、诱导凋亡和阻滞细胞周期[6-7]。我们认为Rh2(S)的抗肿瘤作用可能与组蛋白去乙酰化酶有关联，因此本研究以人红白血病细胞K562为实验对象，初步探讨Rh2(S)对K562细胞增殖、凋亡以及组蛋白去乙酰化酶的影响，观察Rh2(S)的表观遗传修饰作用，为其临床应用提供实验依据。目的研究人参皂苷单体Rh2(S)对人红白血病K562细胞株增殖、细胞周期和凋亡的影响，并从表观遗传学方面探讨Rh2(S)对K562细胞组蛋白乙酰化修饰的影响及组蛋白修饰酶的调控机制。方法取对数生长期的K562细胞，调整细胞密度为5×108/L，实验分组：空白对照组：加入含最大剂量0.1%DMSO的RPMI1640完全培养液；药物组：加入终浓度分别为10、20、40、60、80μmol/L的Rh2(S)。采用CCK-8法测定细胞增殖抑制率；流式细胞仪检测细胞周期分布变化和细胞凋亡；Hoechst染色观察细胞凋亡形态学改变；化学比色法检测细胞中组蛋白修饰酶活性的变化；Western blot检测细胞中组蛋白乙酰化水平的改变和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的表达以及与HDAC相关的信号通路中关键蛋白的表达；免疫荧光检测细胞中HDAC6蛋白定位。结果1. CCK-8结果显示，人参皂苷单体Rh2(S)在体外能有效抑制K562细胞增殖，在10~80μmol/L浓度范围内，其抑制作用呈浓度依赖性，在60μmol/L处达到细胞的半数抑制率，且在48h抑制率达到高峰；2.流式细胞术检测结果显示，60μmol/L Rh2(S)将K562细胞周期阻滞在G0/G1期；20、40、60μmol/L Rh2(S)诱导K562细胞早期凋亡，其凋亡率分别为（8.09±0.86）%、（9.44±0.53）%、（22.80±2.16）%，与空白对照组（2.63±0.14）%相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；3. Hoechst染色结果显示，Rh2(S)能诱导凋亡，经Rh2(S)诱导的各组细胞染色质浓缩聚集，呈典型的凋亡形态学变化；4.化学比色法结果显示，40~60μmol/L Rh2(S)能降低K562细胞中组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的活性，60μmol/L Rh2(S)能提高组蛋白乙酰化酶（histone acetylase, HAT）的活性；5. Western blot结果显示，Bax、Caspase-3（激活型）、p16、p21、p-p38、p-JNK蛋白的表达随Rh2(S)浓度的增加呈上调趋势，Bcl-2、Cyclin D1、CDK4、HDAC1、HDAC2、HDAC6、p-ERK蛋白的表达呈下调趋势（P均＜0.05），HDAC3、HDAC4、p38、JNK、ERK蛋白表达无明显变化（P均＞0.05）；6.免疫荧光结果显示，HDAC6在细胞胞质中表达，经Rh2(S)处理后表达量减少。结论1.人参皂苷Rh2(S)在10~80μmol/L浓度范围内能有效抑制K562细胞增殖，且其抑制作用具有浓度和时间依赖性；2.人参皂苷Rh2(S)促使细胞周期阻滞在G0/G1期，诱导K562细胞凋亡；3.人参皂苷Rh2(S)能够抑制HDAC活性，增加HAT的活性及降低HDAC1、HDAC2、HDAC6蛋白的表达，从而促使K562细胞组蛋白乙酰化水平增加，以及HDAC下游相关的信号通路蛋白的变化，这可能与其抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡的机制有关联。