论文摘要
丙烯酰胺(acrylamide, ACR)是一种水溶性的乙烯基单体,作为用途广泛的化工原料其接触主要包括职业和环境两个方面：一般的职业接触如市政供水处理、纸浆加工等；特殊的职业接触主要指实验室的凝胶电泳操作。此外,一般人群因食用高温油炸食品、吸烟、使用某些化妆品也会摄入一定量的ACR。由此,ACR所致健康危害因其毒效应的“行业广泛性”和“人群普遍性”而日益受到广泛关注,但其致病机理至今尚未阐明。突触素(synapsins)作为决定突触可塑性变化的重要因素,其改变可较为准确地反映突触的分布和密度。本课题组前期研究表明,突触素I(synapsin I)与ACR的神经损伤效应具有较强关联,synapsin I可能在ACR神经损伤过程中发挥重要作用。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是神经营养素(neurotrophins, NTs)家族的重要成员,近年来,有关BDNF的研究逐渐引起神经领域学者的关注。已有的研究提示：内源性BDNF具有多方面的功能,既可联系神经元与刺激因素间的信号传递,也可介导神经网络中神经元之间的交互调节,对神经突触的形成和重塑具有重要意义,而外源性BDNF的效果尚不确切,外源性BDNF对ACR所致损伤的影响尚待阐明。由此,在前期研究的基础上,本文以突触为ACR神经损伤的物质基础,以synapsin I为靶点,研究不同层次(实验动物和细胞)ACR所致神经毒效应及可能的作用机制,以此为基础开展的BDNF机制针对性的干预研究可为防治ACR的神经损伤提供一定的理论依据和技术支撑。1.丙烯酰胺神经损伤动物和细胞检测平台的建立1.1神经毒性动物检测平台的构建ACR腹腔注射(7.5、15、30mg/kg ACR)染毒雄雌性Wistar大鼠,每周6天,连续3周。观察体重、神经行为、组织病理等改变。结果表明,体重-时间变化趋势可较为敏感地反映ACR的一般毒性,试验期间,染毒组大鼠体重增加减缓,30mg/kg ACR组接近染毒终点前体重进入平台期(雄性)或呈下降趋势(雌性)。染毒后第2周末开始,中毒体征日渐显著,表现为进食减少、拖步、肢体无力(双后肢进展到前肢)、腹侧震颤、步态摇摆直至瘫痪：30mg/kg ACR组步态评分分值和热觉指数增加。神经病变明显,病理检查发现以小脑皮质空泡变性、浦肯野细胞固缩为主,而神经系统以外的重要组织器官如心、肝、肺、肾、脾、大脑、胃、肠、睾丸、附睾、卵巢、子宫等未见明显病理学异常。5批次动物染毒后的体重和神经行为学参数的变化规律、病理病变部位、异常体征等未见显著差异。1.2神经毒性细胞检测平台的构建以神经母细胞瘤(neuroblastoma, NB-1)细胞株为基础,采用终浓度为1mmol/1的双丁酰基环腺苷磷酸(dibutyryl cyclic AMP, db-cAMP)诱导处理10天。光镜观察细胞形态,Western-blot检测蛋白表达,甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)检测细胞存活情况并计算IC50。结果提示,诱导10天后细胞间突触结构清晰,神经元特异性烯醇化酶(neuronspecific enolase, NSE)鉴定显示明确的神经元特性：synapsin I表达显著且趋于稳定,由此,构建分化成熟的神经元体系。ACR对诱导成熟后NB-1细胞的IC50为69.8μg/l(48小时)。结合MTT和LDH结果分析,设定进一步机制研究中ACR的系列染毒剂量为40、80和100μg/1,染毒48小时。实验开始和终止时细胞特性相关试验结果未见显著差异。本研究所制备的ACR神经损伤动物和细胞检测平台的基本特点为：染毒集中、相对稳定、神经毒性针对性较强,可基本满足后续研究的需要。2.丙烯酰胺神经损伤的突触素I靶点效应机制研究2.1丙烯酰胺所致神经突触损伤效应在实验动物水平探讨ACR对神经突触结构和功能可塑性的影响。电镜检测突触结构参数的变化；免疫组化和Western-blot法相结合反映突触特异位点synapsin I的定性、定位、定量变化。结果提示,与对照组比较,30mg/kg ACR组大鼠的突触活性带长度显著缩短(P<0.05),synapsin I的定位无明显变化,均位于脊髓背角灰质神经纤维末梢：对照组synapsin I着色较深,呈强阳性,随染毒剂量增加阳性信号渐减弱,30mg/kg ACR组synapsin I蛋白含量较对照显著降低(P<0.05)。在突触可塑性变化的基础上,从神经冲动动态传导的角度探讨下游神经元的继发损伤效应。电镜观察神经元超微结构变化；定磷法测定背根神经节中ATP酶的活性。结果提示,细胞器损伤及神经纤维结构紊乱,随染毒剂量增加,ATP酶活性降低。可见,ACR损伤神经突触,表现为突触的结构和功能异常；神经突触损伤继发下游神经细胞损伤效应；synapsin I是ACR所致突触可塑性损伤的重要因子,在功能可塑性中发挥重要作用,可能是ACR神经损伤的重要靶点之一,成为机制研究的重要线索。2.2突触素I与SNARE复合体在丙烯酰胺神经损伤中的相关变化在细胞水平探讨ACR神经损伤过程中,synapsin I与SNARE复合体(可溶性N-甲基马来酰胺敏感因子附着蛋白受体soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor proteins, SNAREs包括syntaxin、SNAP-25、VAMP)的关联。siRNA下调synapsin I蛋白后,Western-blot进行SNAREs目关蛋白表达检测。结果提示,ACR所造成的神经细胞形态损伤明显,突触结构破坏,synapsinI蛋白水平显著降低(P<0.05)。siRNA下调靶点蛋白synapsin I后再对细胞给予40μg/l ACR染毒处理,SNAP-25蛋白表达增加,与对照比较差异有显著性(P<0.05),VAMP和syntaxin变化不显著(P>0.05)。3.丙烯酰胺神经损伤的靶点干预研究3.1BDNF干预效应的体外研究在体外试验条件下探讨不同剂量BDNF(50、75和100ng/ml)对ACR所致神经损伤的影响。光镜形态学观察；MTT法检测细胞相对存活率；Western-blot检测synapsin I蛋白表达。结果提示,染毒后细胞形态和突触结构损伤明确；50和75ng/mlBDNF干预可减轻ACR的细胞毒性,细胞相对存活率较60μg/l ACR单独染毒组显著增加(P<0.05)；BDNF剂量增加到一定水平(100ng/ml),干预效果减弱,细胞相对存活率与60μg/l ACR组比较差异不显著(P>0.05)。ACR染毒致胞内Ca2+浓度增加,BDNF在一定剂量范围内(50-75ng/ml)可对抗胞内Ca2+超载,胞内Ca2+浓度较60μg/l ACR染毒组降低(P<0.05)；当BDNF达到较高剂量时(100ng/ml),该干预效应减弱,与60μg/l ACR组比较差异不显著(P>0.05)。50-75ng/mlBDNF干预可对神经突触发挥一定保护作用,synapsin I蛋白含量显著高于60lg/l ACR染毒组(P<0.05); BDNF剂量增加到一定水平(100ng/ml)时,synapsin I表达量降低,与60μg/l ACR组比较差异不显著(P>0.05)。可见,BDNF在适宜剂量范围内(50-75ng/ml)对ACR所致神经损伤具有一定的干预效果,可能是其对抗胞内钙超载,上调特异位点synapsin I蛋白含量,促进神经递质释放,维持突触结构的完整。3.2BDNF干预效应的体内研究在体内实验条件下探讨BDNF对ACR所致神经损伤的干预效应。雌性Wistar大鼠随机分为溶剂对照组(生理盐水)、干预剂对照组(48μg/kgBDNF)、ACR染毒组(30mg/kgACR)和低、中、高剂量BDNF (3、12、48μg/kgBDNF)干预组。ACR腹腔注射(30mg/kg ACR)染毒,每周6天,连续3周,对照组给予生理盐水。BDNF自第2周初在30mg/kg ACR腹腔注射前10分钟尾静脉注射给药,隔日1次,直至ACR染毒结束时止,首次剂量加倍；干预剂对照组除无染毒因素外与高剂量干预组操作一致。步态评分和后肢撑力距离测定评价神经行为异常；检测脑分区、脊髓、坐骨神经等组织的超微结构；ELISA法检测外周血(血浆、血清)、神经组织(中枢、周围)中BDNF的含量；Western-blot检测synapsin I蛋白表达。结果提示,与30mg/kgACR染毒组比较,高剂量BDNF干预组对实验大鼠具有一定的保护作用,实验结束时,高剂量(48μg/kgBDNF)干预组大鼠体重高于30mg/kgACR染毒组,异常体征弱于ACR染毒组,步态评分和后肢撑力距离低于ACR染毒组(P<0.05)。ACR染毒不同时点时血浆、血清、中枢神经(脑)BDNF的变化趋势较为一致,均为染毒初期短暂增加后逐渐降低；而周围神经(坐骨神经)BDNF染毒初期短暂降低后出现波动。实验结束时,染毒组与各剂量干预组血浆BDNF含量均较对照显著降低(P<0.05),高剂量BDNF干预组显著高于30mg/kg ACR染毒组(P<0.05)。结论：ACR引起神经突触结构和功能损伤,synapsin I是损伤作用的关键效能因子,synapsin I影响SNAREs的蛋白表达,其中SNAP-25的变化最为显著,可能对SNAREs的形成和解离发挥一定影响,在ACR所致突触损伤中发挥重要作用；适当剂量的BDNF (50-75ng/ml)对ACR诱导的神经损伤具有一定的干预效果,可能机制在于对抗胞内钙超载,上调synapsin I蛋白水平,促进神经递质释放,维持突触结构的完整。