论文摘要
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种进行性的神经退行性疾病，随着人口老龄化的加剧，AD的患病人数在不断增加，这就给社会和家庭带来了沉重的负担。然而目前用以治疗AD的药物，比如抗胆碱酯酶药物，只能缓解某些症状，不能从根本上修复神经元和阻止疾病的发展。因此开发能够阻止病程发展、延缓AD发生的有效治疗药物极为必要。β淀粉样蛋白（β-amyliod protein，Aβ）沉积形成的淀粉样斑块和tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）是AD的两大主要病理特征，同时Aβ引起的淀粉样沉积也是AD发生的始动因素，并导致AD患者的神经元退化。前期研究以及国内外文献已经报道睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）作为神经营养因子家族的成员，不仅能够促进神经元的生长，维持细胞的存活，而且能够显著减少Aβ的聚集和沉积，这也是AD患者所需治疗的主要方面。故CNTF具有治疗AD的良好前景。但CNTF是蛋白质大分子，很难透过血脑屏障（blood-brainbarrier，BBB）到达靶部位与其受体结合发挥作用，这就限制了CNTF的临床应用。人类免疫缺陷病毒HIV-1的反式激活蛋白（Trans-activator transcription，TAT）是一种有效的蛋白转导域（protein transduction domain，PTD），它能携带外源性大分子并将其转运至细胞内，这就为分子量较大且难跨膜的药物提供了良好的改造手段。本课题将TAT和截短式的（truncated）CNTF基因经过重组并在大肠杆菌中表达，再经分离纯化获得TAT-tCNTF融合蛋白。随后考察了TAT-tCNTF的透膜特性和透膜机制，以及融合蛋白对Aβ损伤细胞和Aβ损伤小鼠模型的作用和作用机制。采用双室双层细胞在体外建立血脑屏障细胞模型，通过检测双室模型下层中CF488A标记的TAT-tCNTF的荧光强度，发现TAT-tCNTF能够跨过BBB细胞模型，并且随着时间的延长跨过BBB细胞模型的蛋白增加。在体外培养的SH-SY5Y细胞中，TAT-tCNTF能够顺利跨过细胞膜而进入到细胞内，而rhCNTF却较难通过生物膜，基本不能在细胞内观察到其荧光标记的荧光信号。由于TAT-tCNTF的跨膜性能可能与TAT相似，而TAT主要通过内吞作用跨过生物膜，故用内吞抑制剂对TAT-tCNTF的跨膜效应进行研究，发现巨胞饮抑制剂细胞松弛素D（cytochalasin D，CD）和盐酸阿米洛利（amiloride hydrochloride，AMI）能够抑制TAT-tCNTF进入细胞，明确了TAT-tCNTF主要是通过巨胞饮方式进入细胞。然而CD并未完全阻止TAT-tCNTF跨膜，该作用可能与CD影响细胞内F-actin结构和细胞内Ca2+含量有关。在小鼠体内，腹腔注射TAT-tCNTF后取材，对海马组织切片进行TAT的免疫荧光实验，观察到TAT-tCNTF在海马区有分布，证明TAT-tCNTF能够穿过血脑屏障进入大脑。在体外，TAT-tCNTF跨过生物膜后能够缓解Aβ引起的细胞内损伤，提高受Aβ损伤细胞的活力并降低Aβ引起的早期凋亡。本课题在体外细胞中也研究了TAT-tCNTF对损伤细胞的作用。利用体外分离培养的原代海马神经元，Aβ处理后其细胞活力降低、早期凋亡增加，而经TAT-tCNTF处理后，海马神经元的细胞活力增加、早期凋亡减少。在体内侧脑室注射Aβ能够明显引起小鼠脑内淀粉样蛋白沉积，而Aβ损伤后的小鼠经腹腔注射TAT-tCNTF，进入小鼠大脑的TAT-tCNTF能够明显减少海马部位Aβ所致的淀粉样沉积。TAT-tCNTF对Aβ损伤小鼠模型的治疗作用不仅体现在组织病理学上，还表现在小鼠的行为学上。在Morris水迷宫实验中，Aβ处理的小鼠较对照组的逃避潜伏期明显延长而平均游泳速度明显减慢；同时在被动逃避的穿梭箱实验中，Aβ处理的小鼠较对照组首次电击时间短而限定时间内遭受电击的次数多，这些都反映出Aβ导致了小鼠学习记忆能力的减退。TAT-tCNTF治疗后的Aβ损伤小鼠在以上方面均有所改善。对Aβ损伤小鼠的脑组织进行取材切片，并对海马部位进行Ki67免疫组织化学染色，发现Aβ能够减少小鼠海马部位的DG区、CA1区和CA3区的Ki67+细胞数，western blot检测发现Aβ损伤小鼠的海马区cyclinD1蛋白表达量也明显下降，证明Aβ能够抑制小鼠海马区的细胞增殖；而经TAT-tCNTF治疗的小鼠Ki67+细胞数和cyclinD1蛋白表达量较多，说明TAT-tCNTF能够改善Aβ对小鼠海马细胞的生长抑制作用。除此之外，NeuN与Ki67的免疫组化实验证明NeuN+的神经元细胞的生长也受到Aβ的抑制，同样TAT-tCNTF能够拮抗Aβ的这种作用。BrdU滞留实验检测发现Aβ损伤小鼠的海马DG区、CA1区和CA3区的BrdU+细胞数均明显增多，同样证明细胞增殖减慢，与Ki67的免疫组织化学检测以及cyclinD1蛋白表达量检测结果一致；BrdU+GFAP免疫荧光双标实验显示Aβ损伤小鼠脑内胶质细胞增生，而经TAT-tCNTF治疗的模型小鼠脑内几乎检测不到BrdU+细胞，同时GFAP+细胞数也明显减少，说明TAT-tCNTF能够促进小鼠脑内细胞增殖并缓解Aβ诱导的胶质细胞增生。Western blot检测Aβ前体蛋白（Aβ precursor protein，APP）和tau蛋白及磷酸化tau蛋白的含量，发现TAT-tCNTF几乎不影响APP的蛋白表达量，却明显减少Aβ所致的小鼠脑内tau蛋白过度磷酸化；说明TAT-tCNTF缓解Aβ损伤小鼠的病理特征并不是影响了Aβ的上游通路，而是通过降低磷酸化tau蛋白的水平，进而降低了神经原纤维缠结（NFTs）的水平。由于TAT-tCNTF的生物学效应主要来自CNTF，故TAT-tCNTF需要与CNTF受体CNTFRα结合，然后激活CNTF的下游通路而发挥作用。本实验考察了CNTF下游通路中Akt、Erk和Stat3分子及其磷酸化形式的蛋白表达量，结果显示在动物实验的第26天和第45天小鼠的DG区、Cx区、SVZ区和海马部位的其他区域，TAT-tCNTF能够明显上调磷酸化Erk的水平，而对于p-Akt/Akt水平仅在第26天的小鼠脑内发现明显改变，然而Stat3的磷酸化并未增多，证明TAT-tCNTF能够激活Erk和Akt通路而未能激活Stat3通路。总之，TAT-tCNTF通过与CNTFRα结合激活Erk和Akt通路，进而明显改善Aβ损伤小鼠的病理和表型。本课题将难以透膜的CNTF经基因重组构建表达出可穿膜的TAT-tCNTF融合蛋白，经验证TAT-tCNTF能穿过生物膜和血脑屏障。同时显示TAT-tCNTF对Aβ损伤细胞和小鼠均有较好的治疗效果，并且阐明了TAT-tCNTF主要以巨胞饮方式跨膜，在体内通过BBB进入小鼠脑内，然后与CNTFRα结合，并通过激活Erk和Akt通路进而达到改善Aβ损伤小鼠的学习记忆能力，促进小鼠脑内海马部位的细胞生长、神经元存活并缓解神经胶质化。本课题解决了CNTF不能在临床应用的难题，为TAT-tCNTF的临床应用提供了依据，同时为AD的治疗提供了良好前景。